Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Funksjonell vurdering av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-Medierte baseredigerere

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Personer med BRCA1 mutasjoner har en høyere risiko for å utvikle kreft, noe som garanterer nøyaktig evaluering av funksjonen til BRCA1-varianter. Her beskrev vi en protokoll for funksjonell vurdering av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-medierte cytosinbaseredigerere som muliggjør målrettet C:G til T:A konvertering i levende celler.

Abstract

Nyere studier har undersøkt risikoen forbundet med BRCA1 genmutasjoner ved hjelp av ulike funksjonelle vurderingsmetoder som fluorescerende reporteranalyser, embryonale stamcellevariasjonsanalyser og terapeutiske legemiddelbaserte sensitivitetsanalyser. Selv om de har avklart mange BRCA1-varianter, er disse analysene som involverer bruk av eksogent uttrykte BRCA1-varianter forbundet med overuttrykksproblemer og kan ikke brukes på post-transkripsjonsregulering. For å løse disse begrensningene har vi tidligere rapportert en metode for funksjonell analyse av BRCA1-varianter via CRISPR-mediert cytosinbaseredigerer som induserer målrettet nukleotidsubstitusjon i levende celler. Ved hjelp av denne metoden identifiserte vi varianter hvis funksjoner forblir tvetydige, inkludert c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T og c.4986+5G>A, og bekreftet at CRISPR-medierte baseredigerere er nyttige verktøy for å reklassifisere variantene av usikker betydning i BRCA1. Her beskriver vi en protokoll for funksjonell analyse av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-basert cytosinbaseredaktør. Denne protokollen inneholder retningslinjer for valg av målområder, funksjonell analyse og evaluering av BRCA1-varianter.

Introduction

Brystkreft type 1 følsomhet genet (BRCA1) er en allment kjent tumor suppressor genet. Fordi BRCA1-genet er relatert til reparasjon av DNA-skader, vil mutasjoner i dette genet føre til en større risiko for kreftutvikling hos en individuell1. Brystkreft, ovariekreft, prostata og bukspyttkjertelkreft er knyttet til arvelige funksjonstap (LOF) mutasjoner av BRCA1 genet 2. Funksjonell vurdering og identifisering av BRCA1-varianter kan bidra til å forebygge og diagnostisere de ulike sykdommene. For å adressere funksjonen til BRCA1-varianter er det utviklet flere metoder for å undersøke patogeniteten til BRCA1-varianter som embryonale stamcellevariasjonsanalyser, fluorescerende reporteranalyser og terapeutiske legemiddelbaserte følsomhetsanalyser3,4,5,6. Selv om disse metodene har vurdert funksjonen til mange BRCA1-varianter, utgjør metodene som involverer eksogent uttrykt BRCA1-varianter begrensninger når det gjelder overuttrykk som kan påvirke nedstrømsregulering, gendosering og proteinfolding7. Videre kan disse analysene ikke utnyttes til posttranscriptional regulering som mRNA spleising, transkripsjon stabilitet, og effekten av uoversettet region8,9.

CRISPR-Cas9-systemet muliggjør målrettet genomredigering i levende celler ogorganismer 10. Gjennom en enkeltguide RNA, Cas9 kan indusere dobbel-strand pauser (DSBs) i kromosomalt DNA på bestemte genomisk loci for å aktivere to DNA reparasjonsveier: feilutsatt nonhomologous end-joining (NHEJ) pathway og feilfri homologi-rettet reparasjon (HDR) sti11. HDR er en presis reparasjonsmekanisme; DSBs indusert av Cas9-kjerner for HDR resulterer imidlertid ofte i uønsket innsetting og sletting (indel) mutasjon. I tillegg trenger den homologe donor DNA-maler for å reparere DNA-skader og har relativt lav effektivitet. Nylig har Cas9 nickase (nCas9) blitt smeltet sammen med cytidindeaminasedomener for målretting av C:G til T:A-erstatninger, uten behov for homologe DNA-maler og DNA-dobbelttrådbryter12,13,14,15. Ved hjelp av cytosinbaseredaktøren utviklet vi en ny metode for funksjonell analyse av BRCA1-varianter16.

I denne studien brukte vi CRISPR-mediert cytosinbaseredaktør, BE314, som induserer effektive C:G til T:A punktmutasjoner, for å implementere den funksjonelle vurderingen av BRCA1-varianter og vellykket identifisert funksjonene til flere BRCA1-varianter (figur 1).

Figure 1
Figur 1: En oversikt over arbeidsflyten for funksjonell vurdering. (A) Skjematisk viser funksjonell vurdering av BRCA1. Fordi LOF av BRCA1 påvirker celle levedyktighet, når BRCA1 mutasjonen er patogen, cellene dør som passasjen tallet øker. (B) Stadier av funksjonsvurderingen av BRCA1. Stiplet boks er valgfritt. Det kan erstattes ved samtidig transfection av gRNA uttrykker og BE3 uttrykker plasmider DNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Metode 1 (generering av HAP1-BE3-cellelinjer) er valgfritt. I stedet for å konstruere en BE3-uttrykkende cellelinje, kan BE3-koding av plasmid-DNA bli samtidig transfisert med gRNA-koding plasmid DNA. Andre varianter av cytosinbaseredaktører, for eksempel BE4max, kan også brukes til svært effektiv baseredigering.

1. Generering av HAP1-BE3 cellelinjer

  1. Bygging av plasmid DNA
    1. For å konstruere lentiBE3-blast plasmid DNA for lentivirusproduksjon, forsterke BE3 koding sekvenser i pCMV-BE3 (Table of Materials) av PCR ved hjelp av high-fidelity polymerase. Utsug PCR-primeren for å inneholde overlappende sekvenser av den fordøyde vektoren (fra trinn 1.1.2) for isotermisk samling somfølger 17:
      primer-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
      primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGG-3'
      MERK: Nukleotider vist i understreket overlapper med den fordøyde vektoren, og disse sekvensene vil være spesifikke for målvektoren som brukeren velger.
    2. Fordøy lentiCas9-blast (Table of Materials) plasmid DNA med restriksjonen enzymer, XbaI og BamHI (1 enhet per 1 μg) i 1 time ved 37 °C. Kjør det fordøyde produktet på en 0,8% agarose gel og rense de riktige båndene (8,6 kb) ved hjelp av et kommersielt gelekstraksjonssett (Table of Materials).
    3. Klone det forsterkede BE3 PCR-produktet og fordøyd lentiCas9-Blast vektor ved hjelp av isotermisk monteringssett (Table of Materials). Bruk totalt 0,02-0,5 pmol av DNA fragmenter og en 1:3 forholdet mellom vektor:insert. Forvandle monteringsproduktet til DH5 alfa-kompetente celler18. Tilsett transformantene på en agarplate som inneholder ampicillin (100 μg/ml) og inkuber platen over natten ved 37 °C.
    4. Velg flere kolonier og inokuler dem i 4 ml LB (lysogeny kjøttkraft) medium som inneholder ampicillin (100 μg / ml) og vokse kulturen i en risting inkubator på 180 rpm.
    5. Rens plasmid DNA ved hjelp av et kommersielt plasmid DNA-rensesett (Table of Materials) i henhold til produsentens protokoller.
    6. For å bekrefte DNA kloning suksess, analysere BE3 sekvenser av hver renset plasmid DNA (fra trinn 1.1.5) av Sanger sekvensering ved hjelp av standard og BE3-spesifikke primere (Supplerende tabell 1) og velg den nøyaktige klonet lentiBE3-blast konstruksjon.
      MERK: For å analysere resultatene av Sanger-sekvensering anbefalte vi flere verktøy som BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) og CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Cellekultur og generering av HAP1-BE3 cellelinjer
    1. Oppretthold celler i en sunn tilstand og i en aktivt skilletilstand. Kultur HAP1-celler i Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (Table of Materials) som inneholder 10% føtal storfe serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Kultur HEK293T/17 celler i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (Table of Materials) som inneholder 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin.
      MERK: HAP1 celle er nyttig for genetisk forskning på grunn av det er nesten haploid celler. Cellene kan imidlertid spontant gå tilbake til en diploid tilstand i cellekultur. Berikelse Hoechst 34580 farget1 n-populasjon ved hjelp av flowcytometry vil være nyttig for vedlikehold av haploidy av HAP1 celler19.
    2. Frø 5 x 106 HEK293T/17 celler på en 100 nm rett 1 dag før transfection. På transfection-dagen transfiserer du plasmid-DNA (15 μg lentiBE3-blast, 9 μg psPAX2 for viral emballasje og 6 μg pMD2.G for hetteglasskonvolutt av andre generasjons lentiviralemballasjesystem) ved hjelp av kommersielle transfeksjonsreagenser i henhold til produsentens protokoller (Materialseksjon) 20. Endre mediet ved 6 t etter transfeksjon og høste virusholdig medium ved 48 timer eller 72 timer etter transfeksjon. Filtrer supernatanten ved hjelp av et 0,45 μm filter.
    3. Transdusere lentivirale partikler av BE3 til HAP1-celler ved en MOI (infeksjonsmultiplikitet) på 0,1. For å justere for en passende MOI, bruk seriefortynnede konsentrasjoner av virus. Fjern mediet og erstatt det med justert viral supernatant og frisk kultur medium.
    4. En dag etter transduksjon, endre medium til 10 μg / ml blasticidin (Table of Materials)-inneholder medium og velg de transduserte cellene i 3 dager med blasticidin. Etter blasticidinvalg velger du en brønn med ~10 % av de overlevende cellene for neste trinn.
    5. Etter blasticidinvalg, frø de transduserte cellene på 96-brønnplater med en tetthet på 0,5 celler / brønn for å isolere enkle kloner (f.eks fortynne 50 celler i 20 ml (0,5 celler per 200 μL) kultur medium og aliquot 200 μL per brønn i 96 brønnplate). Inkuber 96-brønnplatene i 2 uker og velg de enkle koloniene for å bekrefte BE3-aktiviteten.
    6. Del enkeltkoloniene i to sett, ett sett for testing av BE3-aktivitet og annet for vedlikehold. Transduser lentiviralpartikler av gRNAer til et av settene for å bekrefte BE3-aktiviteten. Analyser mutasjonsfrekvensen til hver koloni ved hjelp av T7 endonukleær I (T7E1, Materialstabell) analyse eller ved å utføre den målrettede dype sekvenseringsteknikken (trinn 4)21. Velg passende enkeltkloner som er sunne og har en svært aktiv BE3.
      MERK: For å validere nøyaktige mutasjonsfrekvenser anbefaler vi den målrettede dype sekvenseringen enn T7E1-analysen. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) er godt validert målområde for BE3.

2. Design og bygging av BRCA1 rettet mot gRNAs

Figure 2
Figur 2: Et eksempel på et gRNA plasmid DNA. (A) For å effektivt redigere målsekvensen med BE3, er det nødvendig med en NGG PAM (CCN PAM) som plasserer mål C (mål G) i et femkjerners vindu. NGG PAM vises i rødt og basisredigeringsvinduet representeres av en grå boks. (B)GRNA-sekvensen for c.8047C>T (H1283Y) basisredigering er angitt og mål-C:G-parene vises i rødt mens det aktive vinduet er uthevet med en grå boks. For gRNA-kloning legges overhengsekvensene som er angitt med fet skrift i begge endene. Maler for gRNA ble generert ved å annealing de to komplementære oligonukleotider. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

MERK: Positive og negative kontroller av BRCA1-varianter er avgjørende. I denne studien brukes c.5252G>A (R1751Q) og c.4527C>T (Y1509Y) som godartede kontroller. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A og c.3598C>T (Q1200*) brukes som patogene kontroller. Målsekvenser for hver gRNA er oppført i tilleggstabell 1.

  1. Få BRCA1 genomsekvensen fra GenBank på NCBI22.
  2. Søk på 20-bp målområder med Protospacer Adjacent Motif (PAM) sekvensen "NGG" og "CCN" rundt mutasjon av interesse. Mutasjonen av interesse bør være plassert i 4-8 nukleotider i PAM-distale enden av gRNA målsekvenser på grunn av det aktive vinduet i BE3 er 4-8 nukleotider i PAM-distal slutten av gRNA målsekvenser14. I tilfelle av c.8047C> T (H1283Y) - og c.5252G> A (R1751Q)-målretting gRNAs, 5>-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3®- og 5>-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3,sekvensene i fet skrift er aktive vinduer. C til T- og G til A-konverteringer forekommer med henholdsvis NGG og CCN PAM (figur 2A).
    MERK: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 er nyttige nettbaserte verktøy for gRNA-design.
  3. Bestill to komplementære oligonukleotider per gRNA; for de fremre oligonucleotides, legg til "CACCG" til 5°slutten av føringssekvensen, og for omvendt oligonucleotides, legg til "AAAC" til 5'end og "C" til 3 'slutten. Disse ekstra sekvensene er spesifikke for mål-gRNA-uttrykksvektoren (fra trinn 2.5) som brukes for denne protokollen, og brukere bør justeres for alternative gRNA-uttrykksvektorer (figur 2B).
  4. Resuspend oligonucleotid i destillert vann ved en endelig konsentrasjon på 100 μM. Bland de to komplementære oligonucleotides til en endelig konsentrasjon på 10 μM med T4 Ligation buffer (Table of Materials) og varme dem ved 95 ° C i 5 min og avkjøl dem ved romtemperatur for annealing.
  5. Fordøy pRG2 ved hjelp av restriksjonsenzymet, BsaI (1 enhet per 1 μg) i 1 time ved 37 °C (materialtabell). Kjør det fordøyde produktet på 1% agarose gel og rense riktig størrelse band (2,5 kb).
    MERK: I stedet for å bruke en klassisk fordøyelses- og ligationsmetode, kan andre kloningsmetode som Golden Gate kloning brukes.
  6. Ligate den glødede oligonucleotide duplex til vektor DNA ved hjelp av den kjøpte DNA ligase (Table of Materials) i henhold til produsentens protokoll og forvandle dem til DH5 alfa-kompetente celler (Andre E. coli stammer som mye brukt for subcloning også kan brukes).
  7. Tilsett transformantene til en agarplate som inneholder ampicillin (100 μg/ml) og inkuber platen over natten ved 37 °C. Rens plasmid DNA fra flere transformanter og analysere deres gRNA sekvenser av Sanger sekvensering ved hjelp av primere som primers som prime på U6 promotor (Table of Materials).

3. Opprettelse av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-medierte basisredigeringsverktøy

MERK: Hvis HAP1-BE3 cellelinjer ikke brukes, kan BE3-koding av plasmid-DNA samtidig transfiseres med BRCA1-målretting av gRNA. Sammenlignet med samtidig transfection av BE3 og gRNA plasmider, transfection av gRNA plasmid til HAP-BE3 celler indusere effektiv base redigering opp til 3-fold på målet locus i våre hender.

  1. Frø 5 x 105 HAP1-BE3 celler (eller HAP1 celler i tilfelle av co-transfection metoder) per brønn i 24-brønnplater 1 dag før transfection. På tidspunktet for transfection, kulturceller for å nå en passende tetthet (70% -80% samløpet).
  2. Transfect BRCA1-målretting gRNAs ved hjelp av kjøpte transfection reagenser (Table of Materials) i henhold til produsentens protokoll. Bruk 1 μg BRCA1-målrettingav gRNAer (med 1 μg BE3-koding av plasmid-DNA ved samtidig transfeksjonsmetoder) for å indusere C:G til T:A konvertering på BRCA1-målsteder. Inkuber cellene ved 37 °C og subkultur hver 3–4.
  3. Høst cellepellets 3, 10 og 24 dager etter transfection for å analysere base redigering effektivitet (Prøver fra 3 dager etter transfection analyseres regrading som dag 0 prøver).
  4. Trekk ut genomisk DNA ved hjelp av genomisk DNA-rensesett (Materialsekk).
    MERK: Vi anbefaler at du optimaliserer transinfeksjonsforhold med variabelt forhold mellom reagens og DNA. Optimal tilstand for HAP1 transfection er 4:1 rasjon av reagens til DNA i våre hender.

4. Prøveforberedelse for Illumina neste generasjons sekvensering (NGS)

Figure 3
Figur 3: Forberedelse til neste generasjons sekvensering. 1st PCR primer ble designet for å forsterke BRCA1 målstedet på genomisk DNA. Den andrePCR primeren ble designet slik at sekvensene er plassert mer inne enn 1st PCR primer sekvenser. Flere sekvenser vist som en gul linje ble lagt til i begge ender av den andre PCR-primeren for å feste de essensielle sekvensene for å utføre neste generasjons sekvensering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Design de 1st PCR primere for å forsterke BRCA1 målområder. Selv om det ikke er noen begrensning på størrelsen på det første PCR-produktet, anbefales det at en produktstørrelse på <1 kb effektivt forsterker et bestemt område (figur 3).
  2. Design de andre PCR-primerne som ligger inne i detførste PCR-produktet. Vurder størrelsen på amplicon i henhold til NGS leselengde (For eksempel bør størrelsen på amplicon produktet være mindre enn 300 bp for 2 × 150 bp paret-end kjøre for å slå sammen hver lesing). For å feste viktige sekvenser for NGS-analyse, legg til flere sekvenser i 5's slutten av 2nd PCR primere som følger: for de fremre primere, legge til 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCTTCCGATCT-3'-sekvenser til 5-årsen, og legg til 5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCG ATCT-3'-sekvenser til 5-årsslutt.
    MERK: Vi brukte nestet PCR for å redusere amplicon av ikke-spesifikk binding ved å hindre primere fra å feste til ikke-målsekvens.
  3. Forsterk BRCA1-målstedene på det genomiske DNA-et som er oppnådd fra tre tidspunkter. Bruk high-fidelity polymerase i henhold til produsentens protokoll for å minimere PCR-feil. For 1st PCR reaksjon, bruk 100 ng genomisk DNA for forsterkning over 15 sykluser. For denandre PCR-reaksjonen, bruk 1 μL av 1st PCR-produktet for forsterkning over 20 sykluser. Kjør 5 μL avdet andre PCR-produktet på 2 % agarosegel og bekreft størrelsen.
  4. For å feste de essensielle sekvensene for NGS-analyse, forsterke 2nd PCR-produktet ved hjelp av primerne som er oppført nedenfor. For PCR-reaksjonen brukes 1 μL avdet andre PCR-produktet til forsterkning opptil 30 sykluser ved hjelp av høygjengivelsespolymerase.
    1. Hvis du vil utføre multiplekssekvensering for et stort antall biblioteker som skal være samlet og sekvensert samtidig, bruker du fremover (D501 – D508) og omvendte (D701 – D712) primere, som har unik indekssekvens (Tilleggstabell 1). Forsterk hvert utvalg ved hjelp av forskjellige primere sett for å gjennomføre den unike dual indeksering strategi.
    2. Kjør 5 μL av PCR-produktet på 2 % agarose gel for å bekrefte størrelsen, og rense amplicon ved hjelp av et kommersielt PCR-oppryddingssett (Table of Materials). Bland hvert utvalg i like store mengder for å opprette et NGS-bibliotek.
  5. Kvantifisere NGS-biblioteket ved 260 nm bølgelengde ved hjelp av spektrofotometre og fortynne NGS-biblioteket til konsentrasjon på 1 nM ved hjelp av resuspensjonsbuffer eller 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. Forbered 100 μL av biblioteket fortynnet til riktig lastekonsentrasjon avhengig av bibliotektypene (For eksempel forberede 200 pM av biblioteket for Nextera DNA Flex).
    1. Som en kontroll, kombinere phiX med den fortynnede prøven som passer for typen kit.
    2. Legg biblioteket på patronen og kjør NGS i henhold til produsentens protokoll. Illumina iSeq 100- eller Miseq-systemer kan sekvensere ampliklonene i forskjellig lengde opptil 300 bp for enkeltlest eller paret ende. Vi anbefalte over 10 000 lesing per mål amlicon for grundig analyse av baseredigeringseffektivitet.

5. Analyse av grunnleggende redigeringseffektivitet for funksjonell vurdering av BRCA1-varianter

  1. Analyser grunnleggende redigeringseffektivitet ved hjelp av MAUND24. Grunnleggende redigeringseffektivitet beregnes som beskrevet nedenfor.
    Equation 1
    Hvis flere cytosiner finnes i det aktive BE3-vinduet, vurderes bare C til T-konverteringen som er målrettet for evaluering av BRCA1-varianten. For eksempel, hvis sekvensene av BE3 aktive vinduet er "C4A5T6C7T8," de mulige sekvensene som genereres av base redigering er "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8", og "T4A5T6T7T8". På dette tidspunktet, hvis posisjon 4 er den målrettede posisjonen for ønsket BRCA1-variant, vurderes bare sekvensen ""T4A5T6C7T8"for beregning av grunnleggende redigeringseffektivitet.
    MERK: Vi anbefaler også andre webverktøy for analyse av baseredigeringsaktivitet som CRISPResso225og BE-analysator23.
  2. Kontroller resultatene ved hjelp av positive og negative kontroller av BRCA1-varianter. Baseredigeringseffektiviteten til godartet kontroll bør forbli den samme, mens de av den patogene kontrollen bør reduseres over tid.
  3. Beregn den relative baseredigeringseffektiviteten til BRCA1-varianter og bestem deres patogenitet. De signifikante forskjellene mellom dag 0 og dag 21-prøver analyseres passende statistisk analyse som t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eksperimentelle tilnærmingene som er beskrevet i denne protokollen, muliggjør funksjonell vurdering av endogene BRCA1-varianter generert av CRISPR-baserte cytosinbaseredaktører. For å velge passende cellelinjer for funksjonell vurdering av BRCA1-varianter, bør forskerne bekrefte at BRCA1 er viktig gen i de målrettede cellelinjene. For eksempel transfiserte vi først Cas9 og gRNAer i HAP1-cellelinjer for å forstyrre BRCA1 og analyserte mutasjonsfrekvenser ved målrettet dyp sekvensering. Vi fant at mutasjonsfrekvensene gikk betydelig ned over tid i HAP1-cellelinjer (figur 4A). Disse resultatene viste at BRCA1 er viktig gen for celle levedyktighet i HAP1 cellelinjer. For å undersøke om C:G til T:A substituerte varianter påvirker funksjonen til BRCA1,ble plasmidenes DNA-koding av gRNAer, som kan indusere hver mutasjon, transfected til HAP1-BE3-cellelinjer og substitusjonsfrekvensene ble analysert. De relative substitusjonsfrekvensene til c.3598C>T (s. Q1200*), en patogen variant, dramatisk redusert, mens de av c.4527C> T (p.Y1509Y), en godartet variant, forble lik med tiden (figur 4B). I ClinVar-databasen, c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) og c.5056C>T (p.H1686Y) av BRCA1 rapporteres som varianter av usikker betydning. Vi analyserte funksjonen til disse variantene ved hjelp av metodene nevnt ovenfor, og fant at nukleotiderstatningsfrekvensene til disse tre variantene ble redusert på en tidsavhengig måte (figur 4B). Fra disse resultatene endret de tre substitusjonene BRCA1-funksjonen og kunne kategoriseres som patogene mutasjoner.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater av funksjonell studie av BRCA1 ved hjelp av CRISPR-Cas9-systemer. (A) BRCA1-avbrudd påvirker celle levedyktigheten. HAP1-celler ble transflettet med plasmidkoding spCas9 og to gRNAs rettet mot HENHOLDSVIS BRCA1,og målrettet dyp sekvensering ble utført for cellevariabilitetsanalyse. Mutasjonsfrekvenser av BRCA1 ble redusert på en tidsavhengig måte i celler som ble transfisert med to uavhengige gRNAer, og mutasjonsfrekvensene til CCR5, som ble brukt som en negativ kontroll, forble de samme over tid. (B)Funksjonelle vurderinger av fem BRCA1-varianter. HAP1-BE3-celler ble transfisert med gRNAs induserende BRCA1 mutasjoner, henholdsvis, og målrettet dyp sekvensering ble utført for celle levedyktighet analyse. De relative substitusjonsfrekvensene ble redusert på en tidsavhengig måte i celler på c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T og c.5056C>T og de av c.4527C>T forble den samme. Feilfelt viser standardfeilen for gjennomsnitt. Stjerner betegner forskjellige P-verdier: * P<0,05; ** P<0.005., n.s: ikke signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en enkel metode for funksjonelle vurderinger av BRCA1-varianter ved hjelp av CRISPR-meditert cytosinbaseredigerer. Protokollen beskriver metoder for utforming av gRNAs på mållocus og bygging av plasmid DNAs som de uttrykkes fra. Cytosinbaseredaktører induserer nukleotidkonvertering i et aktivt vindu (i tilfelle BE3, nukleotider 4–8 i PAM-distale enden av gRNA-målsekvensene). Forskeren bør nøye velge målsekvenser fordi alle cytosiner i aktivt vindu kan erstattes med thyminer. Videre, som beskrevet i trinn 5, bør flere cytosiner i et aktivt vindu analyseres nøye for å evaluere funksjonen til BRCA1-varianter.

Et av de viktigste trinnene er transinfeksjon i målcellelinjen, som påvirker den første mutasjonsfrekvensen for BRCA1 funksjonsvurderinger. For å forbedre den første mutasjonsfrekvensen bør forskerne optimalisere leveringsmetodene til cellelinjen av interesse. Som beskrevet i trinn 1, er genereringen av BE3 som uttrykker cellelinjer nyttig alternativ for å øke den opprinnelige mutasjonsfrekvensen. Vi anbefaler ikke lentiviral transduksjon av gRNA i HAP1-BE3-cellene, fordi konstitutivt uttrykk for BE3 og gRNA kan forårsake akkumulativ nukleotidkonvertering, og disse resultatene forstyrrer den funksjonelle vurderingen av BRCA1-varianter.

I tillegg til BE3-medierte metoder som er innført i denne protokollen, anbefales det flere komplementære metoder for å ytterligere utvide de funksjonelle vurderingene av BRCA1-varianter. Først, som beskrevet ovenfor, er mutasjonsfrekvensen i den første prøven viktig for å oppnå sikre resultater av BRCA1-varianter. For å øke baseredigeringseffektiviteten anbefales varianter av cytosinbaseredigerere, for eksempel BE4max. For det andre gjenkjenner BE3 mål-DNA-sekvensen gjennom 5'-NGG-3' PAM-sekvensene, som er en begrensning i å generere ulike typer BRCA1-varianter. Nylig utviklede Cas9-varianter med endrede PAM-sekvenser er nyttige alternativet i dette tilfellet for å utvide målbare BRCA1-varianter 26,27,28. For det tredje induserer BE3 betydelig baseredigering på uønskede nettsteder, og off-target-effekten kan påvirke funksjonell vurdering av BRCA1-varianter29,30,31. For å redusere off-target effekten av BE3, bør målområder for gRNAs nøye velges uten lignende sekvenser i genomet. SECURE-BE3 eller YE1, som har utviklet for å redusere uønsket baseredigering i genom og transkripsjon er nyttigalternativ 32,33. Frem, en metning genom redigering (SGE) metode basert på Cas9-mediert HDR også gode alternativer for funksjonell analyse av BRCA1 varianter19. Metoden har ingen begrensning for valg av målsekvenser og nukleotidposisjoner for BRCA1-varianter. HDR-basert tilnærming er imidlertid relativt mindre effektiv enn basisredigererne, og krever i tillegg design og syntese av donormaler14. Til slutt inkluderer pasientavledede BRCA1-varianter ulike mutasjoner som punktmutasjoner, innsettinger og slettinger. Av disse er punktmutasjoner hovedpopulasjonen av BRCA1-varianter, som ikke bare er C:G til T:A-konvertering, men også A:T til G:C, C:G til G:C og A:T til T:A konverteringer. Til funksjonelle vurderinger av denne typen konverteringer er CRISPR-medierte adenosine baseredaktører og Prime Editors verdifullealternativer 34,35. Raskt utviklende genomteknologier vil muliggjøre funksjonelle vurderinger av mer varierte BRCA1-varianter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (tilskudd 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 og 2018R1A5A2020732 til Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Tags

Kreftforskning utgave 168 CRISPR-Cas baseredigering BE3 BRCA1 funksjonell vurdering Genomteknikk
Funksjonell vurdering av <em>BRCA1-varianter</em> ved hjelp av CRISPR-Medierte baseredigerere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G.,… More

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter