Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

אנשים עם מוטציות BRCA1 יש סיכון גבוה יותר לפתח סרטן, אשר מצדיק הערכה מדויקת של הפונקציה של גרסאות BRCA1. בזאת, תיארנו פרוטוקול להערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס ציטוצין בתיווך CRISPR המאפשרים המרת C:G ממוקדת ל- T:A בתאים חיים.

Abstract

מחקרים אחרונים חקרו את הסיכונים הקשורים מוטציות גנים BRCA1 באמצעות שיטות שונות הערכה תפקודית כגון מבחני כתב פלואורסצנטי, מבחני הכדאיות של תאי גזע עובריים, ו מבחני רגישות מבוססי סמים טיפולית. למרות שהם הבהירו הרבה גרסאות BRCA1, מבחנים אלה הכרוכים בשימוש בגרסאות BRCA1 מבוטאות אקסוגניות קשורות לבעיות דיכוי יתר ולא ניתן להחילן על רגולציה שלאחר שעתוק. כדי לפתור מגבלות אלה, דיווחנו בעבר על שיטה לניתוח פונקציונלי של גרסאות BRCA1 באמצעות עורך בסיס ציטוסין בתיווך CRISPR שגורמים להחלפת נוקלאוטידים ממוקדת בתאים חיים. בשיטה זו, זיהינו וריאנטים שפונקציותיהם נשארות מעורפלות, כולל c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T ו- c.4986+5G>A, ואישר כי עורכי בסיס בתיווך CRISPR הם כלים שימושיים לסיווג מחדש של הווריאנטים בעלי משמעות לא ברורה ב- BRCA1. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח פונקציונלי של גרסאות BRCA1 באמצעות עורך בסיס ציטוצין מבוסס CRISPR. פרוטוקול זה מספק קווים מנחים לבחירת אתרי יעד, ניתוח פונקציונלי והערכה של גרסאות BRCA1.

Introduction

סוג סרטן השד 1 גן רגישות (BRCA1) הוא גן מדכא גידול ידוע. מכיוון שהגן BRCA1 קשור לתיקון נזק לדנ"א, מוטציות בגן זה יובילו לסיכון גדול יותר להתפתחות סרטן אצל אדם1. סרטן השד, השחלות, הערמונית והלבלב מקושרים למוטציות תורשתיות של אובדן תפקוד (LOF) של הגן BRCA1 2. הערכה וזיהוי תפקודי של גרסאות BRCA1 עשוי לסייע במניעה ואבחון של המחלות השונות. כדי לטפל בפונקציה של גרסאות BRCA1, פותחו מספר שיטות ושימשו באופן נרחב לחקירת הפתוגניות של גרסאות BRCA1 כגון מבחני הכדאיות של תאי גזע עובריים, מבחני כתב פלואורסצנטיים, ופעולות רגישות מבוססות סמים טיפוליות3,4,5,6. למרות שיטות אלה העריכו את הפונקציה של הרבה גרסאות BRCA1, השיטות מעורבים אקסוגני לידי ביטוי גרסאות BRCA1 להוות מגבלות במונחים של overexpression שעלול להשפיע על ויסות במורד הזרם, מינון הגן, חלבון מתקפל7. יתר על כן, לא ניתן לרתום מבחנים אלה לרגולציה שלאחר התיאור כגון שחבור mRNA, יציבות תעתיק, והשפעה של אזור לא מתורגם8,9.

מערכת CRISPR-Cas9 מאפשרת עריכת גנום ממוקדת בתאים חיים ואורגניזמים10. באמצעות RNA מדריך יחיד, Cas9 יכול לגרום שברים דו-גדיליים (DSB) ב- DNA כרומוזומלי ב loci גנומי ספציפי על מנת להפעיל שני מסלולי תיקון DNA: שגיאה נוטה סוף הצטרפות (NHEJ) מסלול תיקון מונחה הומולוגית ללא שגיאות (HDR)מסלול 11. HDR הוא מנגנון תיקון מדויק; עם זאת, DSBs המושרה על ידי גרעין Cas9 עבור HDR לעתים קרובות תוצאות הכנסה ומחיקה לא רצויות (indel) מוטציה. בנוסף, הוא זקוק לתבניות דנ"א של תורמים הומולוגיים לתיקון נזקי דנ"א ויש לו יעילות נמוכה יחסית. לאחרונה, Cas9 nickase (nCas9) התמזגו עם תחומי deaminase cytidine עבור מיקוד C:G כדי T:A החלפות, ללא צורך תבניות DNA הומולוגית ו- DNA כפול גדיל שובר12,13,14,15. באמצעות עורך בסיס ציטוצין, פיתחנו שיטה חדשה לניתוח פונקציונלי של גרסאות BRCA116.

במחקר זה השתמשנו בעורך בסיס ציטוצין בתיווך CRISPR, BE314, אשר גורם מוטציות יעילות C:G כדי T:A point, ליישום הערכה תפקודית של גרסאות BRCA1 וזיהה בהצלחה את הפונקציות של מספר גרסאות BRCA1 (איור 1).

Figure 1
איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה להערכה פונקציונלית. (A) סכמטי המציג את ההערכה הפונקציונלית של BRCA1. בגלל LOF של BRCA1 משפיע על הכדאיות של התא, כאשר המוטציה BRCA1 הוא פתוגניים, התאים מתים ככל שמספר המעבר עולה. (B) שלבים של הערכה תפקודית של BRCA1. תיבה מנוקדת היא אופציונלית. זה יכול להיות מוחלף על ידי transfection משותף של gRNA להביע BE3 הבעת DNA פלסמידים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: שיטה 1 (יצירת קווי תא HAP1-BE3) היא אופציונלית. במקום לבנות קו תאים מבטא BE3, ניתן להחדיר דנ"א פלסמיד בקידוד BE3 עם דנ"א פלסמיד מקודד gRNA. גרסאות אחרות של עורכי בסיס ציטוצין, כגון BE4max, גם ניתן להשתמש עבור עריכה בסיסית יעילה מאוד.

1. הדור של קווי התא HAP1-BE3

  1. בניית דנ"א פלסמיד
    1. כדי לבנות את ה- DNA פלסמיד lentiBE3-blast לייצור lentivirus, להגביר את רצפי קידוד BE3 ב pCMV-BE3 (שולחן החומרים) על ידי PCR באמצעות פולימראז נאמנות גבוהה. עצב את פריימר ה- PCR כך שיכיל רצפים חופפים של הווקטור המתעכל (משלב 1.1.2) עבור הרכבה איסותרמית כדלקמן17:
      פריימר-F: 5'-TTTGCCGGAACACAGAGGGGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
      פריימר-R: 5'-CAGAGAAGTTTGGCGGGATCC GACTTTCTCTTCTCTTGGG-3'
      הערה: נוקלאוטידים המוצגים בקו תחתון חופפים לווקטור המתעכל ורצפים אלה יהיו ספציפיים לווקטור היעד שנבחר על-ידי המשתמש.
    2. לעכל lentiCas9-blast(שולחן החומרים)פלסמיד DNA עם אנזימי הגבלה, XbaI ו BamHI (1 יחידה לכל 1 מיקרוגרם) עבור 1 שעה ב 37 °C (69 °F). הפעל את המוצר מתעכל על 0.8% ג'ל agarose לטהר את הלהקות בגודל המתאים (8.6 kb) באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרי(שולחן החומרים).
    3. לשכפל את המוצר המוגבר BE3 PCR וקטור lentiCas9-Blast מתעכל באמצעות ערכת הרכבה isothermal(שולחן החומרים). השתמש בסך הכל 0.02-0.5 pmol של שברי DNA ויחס 1:3 של וקטור:הכנס. להפוך את מוצר ההרכבה לתוך DH5 תאים אלפא מוסמך18. מוסיפים את המשתנים על צלחת אגר המכילה אמפצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ומדגרים את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. בחר מספר מושבות לחסן אותם 4 מ"ל של LB (מרק lysogeny) בינוני המכיל אמפיקילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ולגדל את התרבות באינקובטור רועד ב 180 סל"ד.
    5. לטהר DNA פלסמיד באמצעות ערכת טיהור DNA פלסמיד מסחרית (שולחן החומרים) על פי פרוטוקולי היצרן.
    6. כדי לאשר את הצלחת שיבוט ה- DNA, נתח את רצפי BE3 של כל דנ"א פלסמיד מטוהר (משלב 1.1.5) על-ידי רצף סנגר באמצעות פריימרים סטנדרטיים וספציפיים ל- BE3(טבלה משלימה 1)ובחר את מבנה ה- lentiBE3-blast המשובט המדויק.
      הערה: כדי לנתח את התוצאות של רצף סנגר, המלצנו על מספר כלים כגון BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) ו- CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. תרבות התא ויצירת קווי התא HAP1-BE3
    1. לשמור על תאים במצב בריא ובמצב של חלוקה פעילה. תאי HAP1 תרבות במדיום של Iscove שונה Dulbecco (שולחן החומרים) המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין. תרבות HEK293T/17 תאים במדיום הנשר שונה של Dulbecco (שולחן החומרים) המכיל 10% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
      הערה: תא HAP1 שימושי למחקר גנטי בגלל זה הוא כמעט תאי haploid. עם זאת, התאים יכולים לחזור באופן ספונטני למצב דיפלואיד בתרבית התא. העשרה Hoechst 34580 מוכתם 1n-אוכלוסייה באמצעות flowcytometry יהיה מועיל לשמירה על haploidy של תאי HAP119.
    2. זרע 5 x 106 HEK293T/17 תאים על צלחת 100 ננומטר 1 יום לפני transfection. ביום של transfection, transfect את ה-DNA פלסמיד (15 מיקרוגרם של lentiBE3-blast, 9 מיקרוגרם של psPAX2 עבור אריזה ויראלית, ו 6 מיקרוגרם של pMD2.G עבור מעטפת בקבוקון של 2 הדורהשני למערכת האריזה lentiviral) באמצעות reagents transfection מסחרי על פי פרוטוקולי היצרן (לוח חומרים)20. לשנות את המדיום ב 6 שעות לאחר transfection וקציר וירוס המכיל בינוני ב 48 שעות או 72 שעות לאחר transfection. סנן את supernatant באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר.
    3. לתמר את החלקיקים lentiviral של BE3 לתוך תאי HAP1 ב MOI (ריבוי של זיהום) של 0.1. כדי להתאים את עצמו ל- MOI מתאים, השתמש בריכוזים מדוללים סדרתיים של וירוסים. מוציאים את המדיום ומחליפים אותו במדיום תרבות ויראלית ורעננה.
    4. יום אחד לאחר התמרה, לשנות את המדיום ל 10 מיקרוגרם / מ"ל של blasticidin (שולחן החומרים)המכיל בינוני ובחר את התאים transduced במשך 3 ימים עם blasticidin. לאחר בחירת blasticidin, בחר באר עם ~ 10% של תאים ששרדו לשלב הבא.
    5. לאחר בחירת blasticidin, זרע את התאים transduced על צלחות 96-באר בצפיפות של 0.5 תאים / גם על מנת לבודד שיבוטים בודדים (למשל, לדלל 50 תאים ב 20 מ"ל (0.5 תאים לכל 200 μL) תרבות בינוני aliquot 200 μL לבאר ב 96 צלחת היטב). דגירה צלחות 96-באר במשך 2 שבועות ולבחור את המושבות היחידות כדי לאשר את פעילות BE3.
    6. מחלקים את המושבות הבודדות לשתי קבוצות, אחת קובעת לבדיקת פעילות BE3 והשנייה לתחזוקה. לתמר את החלקיקים lentiviral של gRNAs לתוך אחד הסטים כדי לאשר את פעילות BE3. לנתח את תדירות המוטציה של כל מושבה באמצעות T7 אנדונוקלאאז I (T7E1, טבלה של חומרים)בדיקה או על ידי ביצוע טכניקת רצף עמוק ממוקד (שלב 4)21. בחר שיבוטים בודדים מתאימים שהם בריאים ויש להם BE3 פעיל מאוד.
      הערה: כדי לאמת תדרי מוטציה מדויקים, אנו ממליצים על רצף עמוק ממוקד מאשר T7E1 assay. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) הוא אתר יעד מאומת היטב עבור BE3.

2. תכנון ובנייה של BRCA1 מיקוד gRNAs

Figure 2
איור 2: דוגמה לדנ"א פלסמיד gRNA. (A) כדי לערוך ביעילות את רצף היעד באמצעות BE3, נדרש NGG PAM (CCN PAM) הממקם את היעד C (יעד G) בתוך חלון של חמישה נוקלאוטידים. NGG PAM מוצג באדום וחלון העריכה הבסיסי מיוצג על-ידי תיבה אפורה. (B) רצף gRNA עבור c.8047C>T (H1283Y) עריכת בסיס מצוין ואת זוגות C:G היעד מוצגים באדום בעוד החלון הפעיל מסומן על ידי תיבה אפורה. עבור שיבוט gRNA, רצפי overhang המצוין מודגש מתווספים בשני הקצוות 5ʹ. תבניות עבור gRNA נוצרו על ידי חישול שני אוליגונוקלאוטידים משלימים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הערה: פקדים חיוביים ושליליים של גרסאות BRCA1 הם חיוניים. במחקר זה, c.5252G>A (R1751Q) ו- c.4527C>T (Y1509Y) משמשים כפקדים שפירים. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A ו- c.3598C>T (Q1200*) משמשים כפקדים פתוגניים. רצפי יעד של כל gRNA מפורטים בטבלה משלימה 1.

  1. להשיג את רצף הגנום BRCA1 מ GenBank ב NCBI22.
  2. חפש באתרי היעד של 20 סיביות לשנייה עם רצף המוטיב הסמוך של Protospacer (PAM) "NGG" ו- "CCN" סביב מוטציה של עניין. המוטציה של עניין צריך להיות ממוקם 4-8 נוקלאוטידים בקצה PAM-distal של רצפי היעד gRNA בגלל החלון הפעיל של BE3 הוא 4-8 נוקלאוטידים בקצה PAM-distal של רצפי היעד gRNA14. במקרה של c.8047C>T (H1283Y)- ו- c.5252G>A (R1751Q)-מיקוד gRNAs, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ ו- 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3ʹ, הרצפים באותיות מודגשות הם חלונות פעילים. המרות C עד T ו- G עד A מתרחשות עם NGG ו- CCN PAM, בהתאמה (איור 2A).
    הערה: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 הוא כלים מבוססי אינטרנט שימושיים לעיצוב gRNA.
  3. להזמין שני אוליגונוקלאוטידים משלימים לכל gRNA; עבור האוליגונוקלאוטידים הקדמיים, הוסף "CACCG" לקצה 5ʹ של רצף המדריך, ועבור האוליגונוקלאוטידים ההפוכים, הוסף "AAAC" לקצה 5' ו- "C" לקצה 3'. רצפים נוספים אלה הם ספציפיים לווקטור ביטוי gRNA המשמש המשמש עבור פרוטוקול זה, ויש להתאים משתמשים לווקטורים חלופיים של ביטוי gRNA (איור 2B).
  4. Resuspend אוליגונוקלאוטידים במים מזוקקים בריכוז סופישל100 מיקרומטר.
  5. לעכל pRG2 באמצעות אנזים ההגבלה, BsaI (1 יחידה לכל 1 מיקרוגרם) עבור 1 שעה ב 37 °C(לוח החומרים). הפעל את המוצר מתעכל על 1% ג'ל agarose ולטהר את הלהקה בגודל המתאים (2.5 kb).
    הערה: במקום להשתמש בשיטת עיכול וקשירת קשירה קלאסית, ניתן להשתמש בשיטת שיבוט אחרת כגון שיבוט שער הזהב.
  6. Ligate דופלקס oligonucleotide annealed לדנ"א הווקטורי באמצעות ליגאז DNA שנרכש (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן ולהפוך אותם לתאים DH5 אלפא מוסמך (אחרים E. coli זנים אשר בשימוש נרחב עבור subcloning גם ניתן להשתמש).
  7. מוסיפים את הטרנספורמנטים לצלחת אגר המכילה אמפצילין (100 מיקרוגרם למ"ל) ומדגרים את הצלחת במשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. לטהר DNA פלסמיד מכמה transformants ולנתח רצפי gRNA שלהם על ידי רצף סנגר באמצעות פריימרים אשר prime ב U6 מקדם(טבלה של חומרים).

3. יצירת גרסאות BRCA1 באמצעות כלי עריכה בסיסיים בתיווך CRISPR

הערה: אם לא נעשה שימוש בקווי תא HAP1-BE3, ניתן להצליף ב- BRCA1- gRNA מקודד BE3. בהשוואה להעברה משותפת של פלסמידים של BE3 ו- gRNA, טרנס-פגז של פלסמיד gRNA לתאי HAP-BE3 גרם לעריכת בסיס יעילה של עד פי 3 בלוקוס היעד בידינו.

  1. זרע 5 x 105 תאי HAP1-BE3 (או תאי HAP1 במקרה של שיטות transfection משותף) לכל באר בלוחות 24-באר 1 יום לפני transfection. בזמן ההדבקה, תאי תרבות להגיע לצפיפות מתאימה (70%-80% מפגש).
  2. Transfect BRCA1-מיקוד gRNAs באמצעות ריאגנטים transfection שנרכשו (טבלה של חומרים) על פי פרוטוקול היצרן. השתמש 1 מיקרוגרם של BRCA1-מיקוד gRNAs (עם 1 מיקרוגרם של BE3-קידוד DNA פלסמיד במקרה של שיטות transfection משותף) כדי לגרום C:G כדי T:A המרה באתרי היעד BRCA1. דגירה התאים ב 37 °C (69 °F) ותת-תרבות כל 3-4 ימים.
  3. לקצור את כדורי התא 3, 10, ו 24 ימים לאחר transfection לנתח יעילות עריכת בסיס (דגימות מ 3 ימים לאחר transfection מנותחים שדרוג מחדש כמו יום 0 דגימות).
  4. לחלץ DNA גנומי באמצעות ערכת טיהור DNA גנומי (טבלה של חומרים).
    הערה: אנו ממליצים למטב את תנאי ההעתקה עם יחס משתנה של מגיב לדנ"א. מצב אופטימלי עבור transfection HAP1 הוא 4:1 מנה של מגיב ל- DNA בידיים שלנו.

4. הכנה לדוגמה לריצוף הדור הבא של Illumina (NGS)

Figure 3
איור 3: הכנה לריצוף הדור הבא. פריימר PCR1 st תוכנן כדי להגביר את אתר היעד BRCA1 על DNA גנומי. פריימר PCR2 nd תוכנן כך הרצפים שלה ממוקמים יותר בפנים מאשר 1st PCR פריימר רצפים. רצפים נוספים שהוצגו כסרגל צהוב נוספו בשני קצותיו של פריימר PCR2 nd כדי לצרף את הרצפים החיוניים לביצוע רצף הדור הבא. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. תכנן את פריימרים PCR1 st כדי להגביר את אתרי היעד BRCA1. למרות שאין הגבלה על גודלו של מוצר PCR1 st, גודל מוצר של <1 kb מומלץ להגביר ביעילות אזור מסוים (איור 3).
  2. עצבו את פריימרים2 nd PCR הממוקמים בתוך מוצר PCR1 st. שקול את גודל האמפליקון בהתאם לאורך הקריאה של NGS (לדוגמה, גודל מוצר האמפליקון צריך להיות קטן מ- 300 bp עבור 2 × 150 bp יחד לרוץ סוף למזג כל קריאות). על מנת לצרף רצפים חיוניים לניתוח NGS, להוסיף רצפים נוספים לסוף 5 ' של פריימרים PCR2 nd כדלקמן: עבור פריימרים קדימה, להוסיף 5 '-ACACTCTTTCTCTACTCCTCTTCCGATCT-3' רצפים לקצה 5', ועבור פריימרים הפוכים, להוסיף 5'-GTGGGGGGGGGGAGACGTGTGCTCTTCCG
    הערה: השתמשנו ב- PCR מקונן כדי להפחית את האמפליקון של איגוד לא ספציפי על-ידי מניעת הצמדת פריימרים לרצף שאינו יעד.
  3. להגביר את אתרי היעד BRCA1 על ה-DNA הגנומי המתקבל משלוש נקודות זמן. השתמש פולימראז נאמנות גבוהה על פי פרוטוקול היצרן למזעור שגיאות PCR. לתגובת PCR1 st, השתמשו ב-100 ng של דנ"א גנומי להגברה במשך 15 מחזורים. לתגובת PCR2 nd, השתמש 1 μL של מוצר PCR 1st להגברה מעל 20 מחזורים. הפעל 5 μL של מוצר PCR2 nd על 2% ג'ל agarose ולאשר את הגודל.
  4. על מנת לצרף את הרצפים החיוניים לניתוח NGS, להגביר את המוצר2 nd PCR באמצעות פריימרים המפורטים להלן. לתגובת PCR, μL אחד של מוצר PCR2 nd משמש להגברה של עד 30 מחזורים באמצעות פולימראז בנאמנות גבוהה.
    1. כדי לבצע רצף multiplex עבור מספר גדול של ספריות למאגר ורצף בו-זמנית, השתמש קדימה (D501 – D508) ולהפוך (D701 – D712) פריימרי, אשר יש רצף אינדקס ייחודי (טבלה משלימה 1). להגביר כל מדגם באמצעות ערכות פריימרים שונות כדי לנהל את אסטרטגיית יצירת האינדקס הכפולה הייחודית.
    2. הפעל 5 μL של מוצר PCR על 2% ג'ל agarose כדי לאשר את הגודל, ולטהר את האמפליקון באמצעות ערכת ניקוי PCR מסחרית(שולחן החומרים). ערבבו כל דגימה בכמויות שוות ליצירת ספריית NGS.
  5. לכמת את ספריית NGS באורך גל של 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטרים ולדלל את ספריית NGS לריכוז של 1 ננומטר באמצעות מאגר ההשעיה מחדש או 10 mM Tris-HCl, pH 8.5. הכן 100 μL של הספרייה מדולל לריכוז הטעינה המתאים בהתאם לסוגי הספרייה (לדוגמה, להכין 200 pM של הספריה עבור Nextera DNA Flex).
    1. כפקד, לשלב phiX עם מדגם מדולל המתאים לסוג הערכה.
    2. טען את הספריה על המחסנית והפעל NGS בהתאם לפרוטוקול היצרן. מערכות Illumina iSeq 100 או Miseq יכולות לרצף את האמפליקונים באורך שונה של עד 300 bp עבור קצה לקריאה יחידה או מזווג. המלצנו על מעל 10,000 קריאות לפי אמפליקון יעד לניתוח מעמיק של יעילות העריכה הבסיסית.

5. ניתוח יעילות העריכה הבסיסית להערכה הפונקציונלית של גרסאות BRCA1

  1. נתח את יעילות העריכה הבסיסית באמצעות MAUND24. יעילות העריכה הבסיסית מחושבת כמתואר להלן.
    Equation 1
    אם קיימים ציטוזינות מרובות בחלון הפעיל של BE3, רק ההמרה C עד T המיועדת להערכת המשתנה BRCA1 נחשבת. לדוגמה, אם הרצפים של החלון הפעיל של BE3 הם "C4A5T6C7T8," הרצפים האפשריים שנוצרו על-ידי עריכת בסיס הם "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8",ו- "T4A5T6T7T8". בשלב זה, אם מיקום 4 הוא המיקום המיועד עבור וריאנט BRCA1 הרצוי, אז רק ""T4A5T6C7T8" רצף נחשב לחישוב יעילות עריכת בסיס.
    הערה: אנו ממליצים גם על כלי אינטרנט אחרים לניתוח פעילות עריכה בסיסית כגון CRISPResso225, ו- BE-analyzer23.
  2. אמת את התוצאות באמצעות פקדים חיוביים ושליליים של משתני BRCA1. יעילות העריכה הבסיסית של הפקד שפיר צריך להישאר זהה, ואילו אלה של הפקד הפתוגניים צריך להקטין עם הזמן.
  3. חשב את יעילות העריכה הבסיסית היחסית של משתני BRCA1 וקבע את הפתוגניות שלהם. ההבדלים המשמעותיים בין דגימות יום 0 ויום 21 מנותחים ניתוח סטטיסטי מתאים כגון t-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הגישות הניסיוניות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות הערכה תפקודית של גרסאות BRCA1 אנדוגניות שנוצרו על ידי עורכי בסיס ציטוסין מבוססי CRISPR. כדי לבחור קווי תאים מתאימים להערכה תפקודית של גרסאות BRCA1, החוקרים צריכים לאשר כי BRCA1 הוא גן חיוני בקווי התאים הממוקדים. לדוגמה, החרצנו לראשונה את Cas9 ו- gRNAs לקווי תא HAP1 כדי לשבש את BRCA1 וניתחנו תדרי מוטציה על ידי רצף עמוק ממוקד. גילינו שתדרי המוטציה ירדו משמעותית עם הזמן בקווי התאים HAP1(איור 4A). תוצאות אלה הראו כי BRCA1 הוא גן חיוני עבור הכדאיות של התא בקווי התא HAP1. כדי לחקור אם C:G כדי T:A וריאנטים מוחלפים להשפיע על הפונקציה של BRCA1, gRNAs קידוד DNA פלסמידים, אשר יכול לגרום לכל מוטציה, הועברו לקווי התא HAP1-BE3 ותדרי ההחלפה נותחו. תדרי ההחלפה היחסיים של c.3598C>T (עמ' Q1200*), גרסה פתוגנית, ירדו באופן דרמטי, ואילו אלה של c.4527C>T (עמ' 1509Y), גרסה שפירה, נשארו דומים עם הזמן (איור 4B). במסד הנתונים ClinVar, c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) ו- c.5056C>T (p.H1686Y) של BRCA1 מדווחים כגרסאות בעלות משמעות לא ברורה. ניתחנו את הפונקציה של גרסאות אלה בשיטות שהוזכרו לעיל ומצאנו שתדרי ההחלפה של נוקלאוטידים של שלוש גרסאות אלה ירדו באופן תלוי זמן (איור 4B). מתוצאות אלה, שלושת ההחלפות שינו את תפקוד BRCA1 וניתן לסווג אותן כמוטציות פתוגניות.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של מחקר פונקציונלי של BRCA1 באמצעות מערכות CRISPR-Cas9. (A)הפרעה BRCA1 משפיע על הכדאיות של התא. תאי HAP1 נחתכו עם spCas9 קידוד פלסמיד ושני gRNAs מיקוד BRCA1, בהתאמה, רצף עמוק ממוקד בוצע עבור ניתוח הכדאיות של התא. תדרי המוטציה של BRCA1 ירדו באופן תלוי זמן בתאים שהוטבעו עם שני gRNAs עצמאיים, ותדרי המוטציה של CCR5, ששימשו כפקד שלילי, נשארו זהים לאורך זמן. (B)הערכות פונקציונליות של חמש גרסאות BRCA1. תאי HAP1-BE3 נחתכו עם gRNAs גרימת מוטציות BRCA1, בהתאמה, רצף עמוק ממוקד בוצע עבור ניתוח הכדאיות של התא. תדרי ההחלפה היחסיים ירדו באופן תלוי זמן בתאים של c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T, ו- c.5056C>T ואלה של c.4527C>T נשארו זהים. קווי שגיאה מציגים את השגיאה הסטנדרטית של ממוצע. כוכביות מציינות ערכי P שונים: * P<0.05; ** P<0.005., n.s. : לא משמעותי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה להערכות פונקציונליות של משתני BRCA1 באמצעות עורך בסיס ציטוצין במדיטציה CRISPR. הפרוטוקול מתאר שיטות לתכנון gRNAs בלוקוס היעד ובניית DNAs פלסמיד שממנו הם באים לידי ביטוי. עורכי בסיס ציטוסין לגרום המרה nucleotide בחלון פעיל (במקרה של BE3, נוקלאוטידים 4-8 בקצה PAM-דיסטלי של רצפי היעד gRNA). החוקר צריך לבחור בקפידה רצפי יעד כי כל ציטוזינות בחלון פעיל ניתן להחליף thymines. יתר על כן, כמתואר בשלב 5, ציטוזינות מרובות בחלון פעיל צריך להיות מנותח בקפידה כדי להעריך את הפונקציה של גרסאות BRCA1.

אחד הצעדים החשובים ביותר הוא transfection בקו תא היעד, אשר משפיע על תדירות המוטציה הראשונית עבור הערכות תפקודיות BRCA1. כדי לשפר את תדירות המוטציה הראשונית, החוקרים צריכים לייעל את שיטות האספקה לקו התא המעניין. כפי שמתואר בשלב 1, הדור של BE3 המבטא קווי תאים הוא אפשרות שימושית כדי להגדיל את תדירות המוטציה הראשונית. אנו לא ממליצים על התמרה lentiviral של gRNA לתוך התאים HAP1-BE3, כי ביטוי מכונן של BE3 ו gRNA יכול לגרום המרה נוקלאוטידים מצטברים, ותוצאות אלה להפריע הערכה תפקודית של גרסאות BRCA1.

בנוסף לשיטות בתיווך BE3 שהוכנסו בפרוטוקול זה, מומלץ להרחיב עוד יותר את ההערכות הפונקציונליות של גרסאות BRCA1. ראשית, כפי שתואר לעיל, תדירות המוטציה במדגם הראשוני חשובה על מנת להשיג תוצאות בטוחות של גרסאות BRCA1. כדי להגביר את יעילות העריכה הבסיסית, מומלץ לבצע וריאנטים של עורכי בסיס ציטוצין, כגון BE4max. שנית, BE3 לזהות רצף DNA היעד דרך רצפי PAM 5'-NGG-3', המהווה מגבלה ביצירת סוגים שונים של גרסאות BRCA1. גרסאות Cas9 שפותחו לאחרונה עם רצפי PAM ששונו הם אפשרות שימושית במקרה זה כדי להרחיב את גרסאות BRCA1 ליעד26,27,28. שלישית, BE3 גורם לעריכת בסיס משמעותית באתרים לא רצויים ואת האפקט מחוץ ליעד יכול להשפיע על הערכה תפקודית של גרסאות BRCA129,30,31. כדי להפחית את ההשפעה מחוץ ליעד של BE3, אתרי היעד של gRNAs יש לבחור בקפידה ללא כל רצפים דומים בגנום. SECURE-BE3 או YE1, אשר התפתח להפחתת עריכת בסיס לא רצויה בגנום ותעתיק הם אפשרות שימושית32,33. Forth, שיטת עריכת גנום רוויה (SGE) המבוססת על HDR בתיווך Cas9 גם אפשרויות נהדרות לניתוח פונקציונלי של גרסאות BRCA119. לשיטה אין הגבלה לבחירת רצפי יעד ועמדות נוקלאוטידים של משתני BRCA1. עם זאת, גישה מבוססת HDR היא יחסית פחות יעילה מאשר עורכי הבסיס ובנוסף דורש עיצוב וסינתזה של תבניות התורמים14. לבסוף, וריאנטים BRCA1 שמקורם בחולה כוללים מגוון רחב של מוטציות כגון מוטציות נקודתיות, הכנסות ומחיקות. מתוכם, מוטציות נקודתיות הן אוכלוסייה עיקרית של גרסאות BRCA1, שהן לא רק המרת C:G ל- T:A, אלא גם A:T ל- G:C, C:G ל- G:C, ו- A:T ל- T:A המרות. כדי הערכות פונקציונליות של סוגים אלה של המרות, עורכי בסיס אדנודין בתיווך CRISPR ועורכי ראש הם אפשרויות יקרות ערך34,35. טכנולוגיות הנדסת גנום המתפתחות במהירות יאפשרו הערכות תפקודיות של גרסאות BRCA1 מגוונות יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הלאומית של קוריאה (מענקים 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, ו 2018R1A5A2020732 כדי Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

Tags

חקר הסרטן גיליון 168 CRISPR-Cas עריכת בסיס BE3 BRCA1 הערכה תפקודית הנדסת גנום
הערכה פונקציונלית של גרסאות <em>BRCA1</em> באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G.,… More

See, J. E., Shin, H. R., Jang, G., Kweon, J., Kim, Y. Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors. J. Vis. Exp. (168), e61557, doi:10.3791/61557 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter