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Cancer Research

Évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base à base de CRISPR

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Les personnes atteintes de mutations BRCA1 ont un risque plus élevé de développer un cancer, ce qui justifie une évaluation précise de la fonction des variantes BRCA1. Ci-après, nous avons décrit un protocole pour l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 à l’aide d’éditeurs de base de cytosine à base crispr- médiatisés qui permettent la conversion ciblée de C:G à T:A dans les cellules vivantes.

Abstract

Des études récentes ont étudié les risques associés aux mutations du gène BRCA1 à l’aide de diverses méthodes d’évaluation fonctionnelles telles que les essais de reporter fluorescent, les essais de viabilité des cellules souches embryonnaires et les tests thérapeutiques de sensibilité à base de médicaments. Bien qu’ils aient clarifié beaucoup de variantes BRCA1, ces analyses impliquant l’utilisation de variantes BRCA1 exprimées exogènement sont associées à des problèmes de surexpression et ne peuvent pas être appliquées à la régulation post-transcriptionnelle. Pour résoudre ces limitations, nous avons précédemment rapporté une méthode pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA1 par l’intermédiaire de l’éditeur de base de cytosine CRISPR-mentté qui induisent la substitution ciblée de nucléotide dans les cellules vivantes. En utilisant cette méthode, nous avons identifié des variantes dont les fonctions restent ambiguës, y compris c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T, et c.4986+5G>A, et a confirmé que les éditeurs de base crispr-médiatisés sont des outils utiles pour reclassifier les variantes d’importance incertaine dans BRCA1. Ici, nous décrivons un protocole pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA1 utilisant l’éditeur de base de cytosine crispr-basé. Ce protocole fournit des lignes directrices pour la sélection des sites cibles, l’analyse fonctionnelle et l’évaluation des variantes BRCA1.

Introduction

Le gène de susceptibilité de type 1 du cancer du sein (BRCA1) est un gène suppresseur de tumeur largement connu. Puisque le gène BRCA1 est lié à la réparation des dommages d’ADN, les mutations dans ce gène conduirait à un plus grand risque de développement de cancer dans unindividu 1. Les cancers du sein, de l’ovaire, de la prostate et du pancréas sont liés à des mutations héréditaires de perte de fonction (LOF) du gène BRCA1 2. L’évaluation fonctionnelle et l’identification des variantes BRCA1 peuvent aider à prévenir et à diagnostiquer les diverses maladies. Pour répondre à la fonction des variantes BRCA1, plusieurs méthodes ont été développées et largement utilisées pour étudier la pathogénie des variantes BRCA1 telles que les essais de viabilité des cellules souches embryonnaires, les essais de reporter fluorescent et les essais thérapeutiques de sensibilité à base demédicaments 3,4,5,6. Bien que ces méthodes aient évalué la fonction d’un grand nombre de variantes BRCA1, les méthodes impliquant des variantes BRCA1 exprimées exogènement posent des limites en termes de surexpression qui pourraient affecter la régulation en aval, la posologie des gènes et le pliage desprotéines 7. En outre, ces analyses ne peuvent pas être exploitées au règlement posttranscriptionnel tel que l’épissage d’ARNm, la stabilité de transcription, et l’effet de la régionnon traduite 8,9.

Le système CRISPR-Cas9 permet l’édition ciblée du génome dans les cellules vivantes et lesorganismes 10. Grâce à un ARN à guide unique, Cas9 peut induire des ruptures à double brin (DSB) dans l’ADN chromosomique à des loci génomiques spécifiques afin d’activer deux voies de réparation de l’ADN : la voie de jointage final non homologue sujette aux erreurs (NHEJ) et la voie de réparation dirigée par homologie sans erreur (HDR)11. HDR est un mécanisme de réparation précis; cependant, les DSBs induits par la nucléase de Cas9 pour HDR ont souvent comme conséquence l’insertion et la mutation non désirées d’insertion et de suppression (indélébile). En outre, il a besoin de modèles d’ADN de donneur homologue pour réparer les dommages causés par l’ADN et a une efficacité relativement faible. Récemment, Cas9 nickase (nCas9) ont été fusionnés avec des domaines deaminase de cytidine pour cibler les substitutions C:G à T:A, sans avoir besoin de modèles d’ADN homologues et de ruptures de double brin d’ADN12,13,14,15. En utilisant l’éditeur de base de cytosine, nous avons développé une nouvelle méthode pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA116.

Dans cette étude, nous avons utilisé l’éditeur de base de cytosine crispr-négocié, BE314, qui induit des mutations efficaces de C:G à T:A point, pour mettre en œuvre l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1 et a identifié avec succès les fonctions de plusieurs variantes BRCA1 (Figure 1).

Figure 1
Figure 1 : Aperçu du flux de travail pour l’évaluation fonctionnelle. (A) Schéma montrant l’évaluation fonctionnelle de BRCA1. Puisque le LOF de BRCA1 affecte la viabilité cellulaire, quand la mutation BRCA1 est pathogène, les cellules meurent pendant que le nombre de passage augmente. (B) Étapes de l’évaluation fonctionnelle de BRCA1. La boîte pointillée est facultative. Il peut être remplacé par la co-transfection de l’expression de l’ARN g et be3 exprimant l’ADN des plasmides. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Protocol

REMARQUE : La méthode 1 (génération de lignées cellulaires HAP1-BE3) est facultative. Au lieu de construire une lignée cellulaire exprimant be3, l’ADN plasmide codant be3 peut être co-transfecté avec l’ADN plasmide codant pour l’ARN. D’autres variantes des éditeurs de base de cytosine, telles que BE4max, peuvent également être utilisées pour l’édition de base très efficace.

1. Génération de lignées cellulaires HAP1-BE3

  1. Construction de l’ADN plasmide
    1. Pour construire l’ADN plasmide lentiBE3-blast pour la production de lentivirus, amplifiez les séquences de codage BE3 en pCMV-BE3 (Tableau desmatériaux)par PCR à l’aide de polymérase haute fidélité. Concevoir l’amorce PCR pour contenir les séquences qui se chevauchent du vecteur digéré (à partir de l’étape 1.1.2) pour l’assemblage isothermalcomme suit 17:
      amorce-F: 5'-TTTGCCGCCAGAACACAGGACCGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
      amorce-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTTTTTTTGGG-3'
      REMARQUE : Les nucléotides indiqués dans soulignés se chevauchent avec le vecteur digéré et ces séquences seront spécifiques au vecteur de destination choisi par l’utilisateur.
    2. Digest lentiCas9-blast ( Tableau desmatériaux) ADN plasmide avec les enzymes de restriction, XbaI et BamHI (1 unité par 1 μg) pendant 1 h à 37 °C. Exécutez le produit digéré sur un gel d’agarose de 0,8 % et purifiez les bandes de taille appropriée (8,6 kb) à l’aide d’un kit commercial d’extraction de gel(Table of Materials).
    3. Clonez le produit BE3 PCR amplifié et le vecteur lentiCas9-Blast digéré à l’aide du kit d’assemblage isothermal(Table of Materials). Utilisez un total de 0,02-0,5 pmol de fragments d’ADN et un rapport de 1:3 de vecteur:insert. Transformez le produit d’assemblage en cellules alpha-compétentes DH518. Ajouter les transformateurs sur une plaque d’agar contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et incuber la plaque toute la nuit à 37 °C.
    4. Choisissez plusieurs colonies et inoculez-les dans 4 mL de bouillon de LB (bouillon de lysogène) contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et cultivez la culture dans un incubateur secouant à 180 rpm.
    5. Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit commercial de purification de l’ADN plasmide(Tableau desmatériaux) selon les protocoles du fabricant.
    6. Pour confirmer le succès du clonage d’ADN, analyser les séquences BE3 de chaque ADN plasmide purifié (à partir de l’étape 1.1.5) par séquençage Sanger à l’aide d’amorces standard et spécifique au BE3(tableau supplémentaire 1)et sélectionner la construction exacte clonée de lentiBE3-blast.
      REMARQUE : Pour analyser les résultats du séquençage Sanger, nous avons recommandé plusieurs outils tels que BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) et CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw).
  2. Culture cellulaire et génération de lignées cellulaires HAP1-BE3
    1. Maintenir les cellules dans un état sain et dans un état de division active. Culture cellules HAP1 dans le milieu modifié du Dulbecco d’Iscove (Tableau des matériaux) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline/streptomiycine. Culture HEK293T/17 cellules dans le milieu modifié eagle de Dulbecco (Tableau des matériaux) contenant 10% FBS et 1% pénicilline / streptomycine.
      REMARQUE : La cellule HAP1 est utile pour la recherche génétique en raison de ses cellules presque haploïdes. Cependant, les cellules peuvent revenir spontanément à un état diploïde dans la culture cellulaire. Enrichissement Hoechst 34580 taché 1n-populationen utilisant flowcytometry sera utile pour le maintien de l’haploïda des cellules HAP119.
    2. Graine 5 x 106 cellules HEK293T/17 sur un plat de 100 nm 1 jour avant la transfection. Le jour de la transfection, transfecter l’ADN plasmide (15 μg de lentiBE3-blast, 9 μg de psPAX2 pour l’emballage viral, et 6 μg de pMD2.G pour enveloppe de flacon de 2nd génération système d’emballage lentiviral) en utilisant des réagencés transfection commerciale selon les protocoles du fabricant (Tableau des matériaux)20. Changer le milieu à 6 h après la transfection et récolter le milieu contenant le virus à 48 h ou 72 h après la transfection. Filtrer le supernatant à l’aide d’un filtre de 0,45 μm.
    3. Transduire les particules lentivirales de BE3 en cellules HAP1 à un MOI (multiplicité d’infection) de 0,1. Pour s’adapter à un MOI approprié, utilisez des concentrations de virus diluées en série. Retirez le milieu et remplacez-le par un supernatant viral ajusté et un milieu de culture frais.
    4. Un jour après la transduction, changer le milieu à 10 μg/mL de blasticidine(tableau des matériaux)contenant du milieu et sélectionner les cellules transduced pendant 3 jours avec blasticidine. Après la sélection blasticidine, sélectionnez un puits avec ~10% des cellules survivantes pour l’étape suivante.
    5. Après la sélection de blasticidine, ensemencer les cellules transduced sur des plaques de 96 puits à une densité de 0,5 cellules/puits afin d’isoler les clones simples (p. ex., diluer 50 cellules dans 20 mL (0,5 cellules par 200 μL) milieu de culture et aliquot 200 μL par puits dans 96 plaques de puits). Incuber les plaques de 96 puits pendant 2 semaines et choisir les colonies individuelles pour confirmer l’activité BE3.
    6. Divisez les colonies en deux ensembles, l’un pour tester l’activité BE3 et l’autre pour l’entretien. Transduisez les particules lentivirales des ARN dans l’un des ensembles pour confirmer l’activité BE3. Analyser la fréquence de mutation de chaque colonie à l’aide de l’analyse T7 endonuclease I (T7E1, Tableau des matériaux)ou en effectuant la technique ciblée de séquençage profond (étape 4)21. Sélectionnez les clones simples appropriés qui sont sains et ont un BE3 très actif.
      REMARQUE : Pour valider les fréquences exactes de mutation, nous recommandons le séquençage profond ciblé que l’essai T7E1. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) est un site cible bien validé pour BE3.

2. Conception et construction de BRCA1 ciblant les ARN

Figure 2
Figure 2 : Un exemple d’ADN plasmide de gRNA. (A) Pour modifier efficacement la séquence cible avec BE3, un NGG PAM (CCN PAM) qui place la cible C (cible G) dans une fenêtre de cinq nucléotides est nécessaire. NGG PAM est affiché en rouge et la fenêtre d’édition de base est représentée par une boîte grise. (B) La séquence gRNA pour c.8047C>T (H1283Y) édition de base est indiquée et les paires cible C:G sont affichées en rouge tandis que la fenêtre active est mise en surbrillance par une boîte grise. Pour le clonage de gRNA, les séquences de surplomb indiquées en gras sont ajoutées aux deux extrémités. Des modèles pour gRNA ont été générés en annelant les deux oligonucléotides complémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

REMARQUE : Des contrôles positifs et négatifs des variantes BRCA1 sont essentiels. Dans cette étude, c.5252G>A (R1751Q) et c.4527C>T (Y1509Y) sont employés comme contrôles bénins. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A, et c.3598C>T (Q1200*) sont employés comme contrôles pathogènes. Les séquences cibles de chaque ARN g sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1.

  1. Obtenez la séquence du génome BRCA1 de GenBank à NCBI22.
  2. Recherchez les sites cibles de 20 pb avec la séquence Protospacer Adjacent Motif (PAM) « NGG » et « CCN » autour de la mutation d’intérêt. La mutation d’intérêt devrait être située dans 4-8 nucléotides dans l’extrémité PAM-distal des séquences cibles de gRNA en raison de la fenêtre active de BE3 est 4-8 nucléotides dans l’extrémité PAM-distal des séquences cibles de gRNA14. Dans le cas de c.8047C>T (H1283Y)- et c.5252G>A (R1751Q) ciblant les rRNA, 5'TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3', et 5'-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGCAA-3', les séquences en gras sont des fenêtres actives. Les conversions C à T et G à A se produisent avec NGG et CCN PAM, respectivement (figure 2A).
    REMARQUE : BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 est un outil web utile pour la conception de gRNA.
  3. Commander deux oligonucléotides complémentaires par rRNA; pour les oligonucléotides avant, ajouter « CACCG » à la fin 5 'de la séquence de guide, et pour les oligonucléotides inverses, ajouter « AAAC » à la fin de 5' et « C » à la fin 3'. Ces séquences supplémentaires sont spécifiques au vecteur d’expression de l’ARN gRNA de destination (à partir de l’étape 2.5) utilisé pour ce protocole, et les utilisateurs doivent être ajustés pour tenir compte des vecteurs alternatifs d’expression de l’ARN gRNA (figure 2B).
  4. Resuspendre l’oligonucléotide dans l’eau distillée à une concentration finale de 100 μM. Mélanger les deux oligonucléotides complémentaires à une concentration finale de 10 μM avec le tampon de ligature T4(tableau des matériaux)et les chauffer à 95 °C pendant 5 minutes et les refroidir à température ambiante pour l’annealage.
  5. Digérer le pRG2 à l’aide de l’enzyme de restriction BsaI (1 unité par 1 μg) pendant 1 h à 37 °C(tableau des matériaux). Exécutez le produit digéré avec du gel d’agarose de 1 % et purifiez la bande de taille appropriée (2,5 kb).
    REMARQUE : Au lieu d’utiliser une méthode classique de digestion et de ligature, d’autres méthodes de clonage telles que le clonage golden gate peuvent être utilisées.
  6. Ligate le duplex oligonucléotide annealed à l’ADN vectoriel en utilisant la ligase d’ADN acheté (Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant et les transformer en cellules alpha-compétentes DH5 (Autres souches E. coli qui largement utilisé pour le sous-vêtements peut également être utilisé).
  7. Ajouter les transformateurs à une plaque d’agar contenant de l’ampicilline (100 μg/mL) et incuber la plaque toute la nuit à 37 °C. Purifier l’ADN plasmide de plusieurs transformateurs et analyser leurs séquences d’ARNm par séquençage Sanger à l’aide d’amorce s’amorçant chez U6 promoter (Table of Materials).

3. Création de variantes BRCA1 à l’aide d’outils d’édition de base à base de CRISPR

REMARQUE : Si les lignées cellulaires HAP1-BE3 ne sont pas utilisées, l’ADN plasmide codant BE3 peut être co-transfecté avec l’ARN gRNA de ciblage BRCA1. Comparé à la co-transfection des plasmides de BE3 et de gRNA, la transfection du plasmide de gRNA aux cellules HAP-BE3 induit l’édition efficace de base jusqu’à 3 fois au locus cible dans nos mains.

  1. Graine 5 x 105 cellules HAP1-BE3 (ou cellules HAP1 en cas de méthodes de co-transfection) par puits dans des plaques de 24 puits 1 jour avant la transfection. Au moment de la transfection, les cellules de culture pour atteindre une densité appropriée (70%-80% confluence).
  2. Transfect BRCA1-ciblant les rRNA à l’aide des réacgages de transfection achetés (Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant. Utiliser 1 μg d’ARN de ciblage BRCA1(avec 1 μg d’ADN plasmide codant BE3 en cas de méthodes de co-transfection) pour induire la conversion C:G à T:A sur les sites cibles de BRCA1. Incuber les cellules à 37 °C et sous-culture tous les 3-4 jours.
  3. Récoltez les granulés cellulaires 3, 10 et 24 jours après la transfection pour analyser l’efficacité de l’édition de base (Les échantillons de 3 jours après la transfection sont analysés de reclassement comme échantillons du jour 0).
  4. Extraire l’ADN génomique à l’aide du kit de purification de l’ADNgénomique ( Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Nous recommandons d’optimiser les conditions de transfection avec un rapport variable de réaccente à l’ADN. L’état optimal pour la transfection HAP1 est la ration 4:1 du réaccente à l’ADN dans nos mains.

4. Préparation d’échantillons pour le séquençage de prochaine génération d’Illumina (NGS)

Figure 3
Figure 3 : Préparation au séquençage de prochaine génération. La premièreamorce PCR a été conçue pour amplifier le site cible BRCA1 sur l’ADN génomique. L’amorce PCR 2nd a été conçue de telle sorte que ses séquences sont situées plus à l’intérieur que les séquences d’amorcePCR 1er. Des séquences supplémentaires présentées sous forme de barre jaune ont été ajoutées aux deux extrémités del’amorce PCR 2 nd pour fixer les séquences essentielles pour effectuer le séquençage de prochaine génération. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Concevez lesamorces 1er PCR pour amplifier les sites cibles BRCA1. Bien qu’il n’y ait aucune restriction quant à la taille du1er produit PCR, il est recommandé d’utiliser une taille de produit de 1 kb pour amplifier efficacement une région spécifique (figure 3).
  2. Concevez lesamorces PCR 2 nd situées à l’intérieur du 1er produit PCR. Considérez la taille de l’amplicon selon la longueur de lecture NGS (Par exemple, la taille du produit amplicon devrait être inférieure à 300 bp pour 2 × 150 bp paired-end run pour fusionner chacune des lectures). Afin d’attacher des séquences essentielles à l’analyse ngs, ajouter des séquences supplémentaires à la fin 5' des amorces 2nd PCR comme suit: pour les amorces avant, ajouter 5'-ACACTCTTTCCCCCCCGACGCTTCCGATCT-3' séquences à la fin 5', et pour les amorces inverses, ajouter 5'-GTGACTAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG ATCT-3' séquences à la fin 5' .
    REMARQUE : Nous avons utilisé le PCR imbriqué pour réduire l’amplicon de liaison non spécifique en empêchant les amorces de s’attacher à la séquence non cible.
  3. Amplifier les sites cibles BRCA1 sur l’ADN génomique obtenu à partir de trois points de temps. Utilisez la polymése haute fidélité selon le protocole du fabricant pour minimiser les erreurs pcr. Pour la1re réaction pcr, utilisez 100 ng d’ADN génomique pour l’amplification sur 15 cycles. Pour la réaction PCR 2nd, utilisez 1 μL du 1erproduit PCR pour l’amplification sur 20 cycles. Exécutez 5 μL du produit PCR 2nd sur 2% de gel d’agarose et confirmez la taille.
  4. Afin d’attacher les séquences essentielles pour l’analyse NGS, amplifier le produit PCR 2nd en utilisant les amorces énumérées ci-dessous. Pour la réaction PCR, 1 μL du produit PCR 2nd est utilisé pour l’amplification jusqu’à 30 cycles à l’aide de polymélase haute fidélité.
    1. Pour effectuer le séquençage multiplexe pour qu’un grand nombre de bibliothèques soient mis en commun et séquencés simultanément, utilisez des amorces avant (D501 – D508) et inversées (D701 – D712), qui ont une séquence d’index unique(tableau supplémentaire 1). Amplifiez chaque échantillon à l’aide de différents ensembles d’amorce pour mener la stratégie unique d’indexation double.
    2. Exécutez 5 μL du produit PCR sur du gel d’agarose de 2 % pour confirmer la taille et purifiez l’amplicon à l’aide d’un kit commercial de nettoyage PCR(Table of Materials). Mélangez chaque échantillon en quantités égales pour créer une bibliothèque NGS.
  5. Quantifier la bibliothèque NGS à une longueur d’onde de 260 nm à l’aide de spectrophotomètres et diluer la bibliothèque NGS à une concentration de 1 nM à l’aide d’un tampon de resuspension ou de 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Préparer 100 μL de la bibliothèque dilués à la concentration de chargement appropriée selon les types de bibliothèque (Par exemple, préparer 200 pM de la bibliothèque pour Nextera DNA Flex).
    1. En tant que contrôle, combinez le phiX avec l’échantillon dilué approprié pour le type de kit.
    2. Chargez la bibliothèque sur la cartouche et exécutez ngs selon le protocole du fabricant. Les systèmes Illumina iSeq 100 ou Miseq peuvent séquencer les amplicons de différentes longueurs jusqu’à 300 bp pour une seule lecture ou une extrémité jumelée. Nous avons recommandé plus de 10 000 lectures par amplicon cible pour une analyse approfondie de l’efficacité de l’édition de base.

5. Analyse de l’efficacité de l’édition de base pour l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1

  1. Analyser les gains d’efficacité de l’édition de base à l’aide de MAUND24. L’efficacité de l’édition de base est calculée comme décrit ci-dessous.
    Equation 1
    Si plusieurs cytosines sont présentes dans la fenêtre active BE3, seule la conversion C à T ciblée pour l’évaluation de la variante BRCA1 est envisagée. Par exemple, si les séquences de la fenêtre active BE3 sont " C4A5T6C7T8 « ,les séquences possibles générées par l’édition de base sont " T4A5T6C7T8« , " C4A5T6T7T8« , et " T4A5T6T7T8« . À l’heure actuelle, si la position 4 est la position ciblée de la variante BRCA1 souhaitée, seule la séquence « T4A5T6C7T8» est prise en compte pour calculer l’efficacité de l’édition de base.
    REMARQUE : Nous recommandons également d’autres outils Web pour l’analyse de l’activité d’édition de base telles que CRISPResso225et BE-analyzer23.
  2. Vérifiez les résultats à l’aide de contrôles positifs et négatifs des variantes BRCA1. Les gains d’efficacité de l’édition de base du contrôle bénin devraient rester les mêmes, tandis que ceux du contrôle pathogène devraient diminuer avec le temps.
  3. Calculer l’efficacité relative de l’édition de base des variantes BRCA1 et déterminer leur pathogénie. Les différences significatives entre les échantillons du jour 0 et du jour 21 sont analysées analyse statistique appropriée comme t-test.

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Representative Results

Les approches expérimentales décrites dans ce protocole permettent l’évaluation fonctionnelle des variantes endogènes brca1 générées par les éditeurs de base de cytosine à base de CRISPR. Pour sélectionner les lignées cellulaires appropriées pour l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA1, les chercheurs devraient confirmer que BRCA1 est un gène essentiel dans les lignées cellulaires ciblées. Par exemple, nous avons d’abord transfecté cas9 et gARN en lignées cellulaires HAP1 pour perturber BRCA1 et analysé les fréquences de mutation par séquençage profond ciblé. Nous avons constaté que les fréquences de mutation ont diminué de façon significative au fil du temps dans les lignées cellulaires HAP1( Figure 4A). Ces résultats ont montré que BRCA1 est un gène essentiel pour la viabilité cellulaire dans les lignées cellulaires HAP1. Pour étudier si les variantes substituées de C:G à T:A affectent la fonction de BRCA1,les plasmides codant pour l’ADN des ARN, qui pourraient induire chaque mutation, ont été transfectés aux lignées cellulaires HAP1-BE3 et les fréquences de substitution ont été analysées. Les fréquences de substitution relative de c.3598C>T (p. Q1200*), une variante pathogène, ont considérablement diminué, tandis que celles de c.4527C>T (p.Y1509Y), une variante bénigne, sont demeurées semblables avec le temps (figure 4B). Dans la base de données ClinVar, c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y), et c.5056C>T (p.H1686Y) de BRCA1 sont rapportés comme variantes d’importance incertaine. Nous avons analysé la fonction de ces variantes à l’aide des méthodes mentionnées ci-dessus et avons constaté que les fréquences de substitution nucléotide de ces trois variantes diminuaient d’une manière dépendante du temps (figure 4B). À partir de ces résultats, les trois substitutions ont modifié la fonction BRCA1 et pourraient être classées comme mutations pathogènes.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs de l’étude fonctionnelle de BRCA1 à l’aide des systèmes CRISPR-Cas9. (A) La perturbation brca1 affecte la viabilité de la cellule. Les cellules HAP1 ont été transfectées avec le codage plasmide spCas9 et deux gARN ciblant BRCA1,respectivement, et le séquençage profond ciblé a été exécuté pour l’analyse de viabilité cellulaire. Les fréquences de mutation de BRCA1 ont diminué d’une manière dépendante du temps dans les cellules transfectées avec deux rRNA indépendants, et les fréquences de mutation de CCR5, qui a été employée comme contrôle négatif, sont restées les mêmes au fil du temps. (B) Évaluations fonctionnelles de cinq variantes BRCA1. Les cellules HAP1-BE3 ont été transfectées avec des ARN induisant des mutations BRCA1, respectivement, et le séquençage profond ciblé a été exécuté pour l’analyse de viabilité cellulaire. Les fréquences de substitution relative ont diminué d’une manière dépendante du temps dans les cellules de c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T, et c.5056C>T et ceux de c.4527C>T sont restés les mêmes. Les barres d’erreur affichent l’erreur standard de la moyenne. Les astérisques désignent différentes valeurs P : * P<0.05; ** P<0.005., n.s: pas significatif. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple pour les évaluations fonctionnelles des variantes BRCA1 à l’aide de l’éditeur de base de cytosine médité par CRISPR. Le protocole décrit les méthodes de conception des ARN à locus cible et de construction des ADN plasmides à partir de laquelle ils sont exprimés. Les éditeurs de base de cytosine induisent la conversion nucléotide dans une fenêtre active (en cas de BE3, nucléotides 4-8 dans l’extrémité PAM-distal des séquences cibles de gRNA). Le chercheur doit choisir soigneusement les séquences cibles parce que toutes les cytosines dans la fenêtre active peuvent être remplacées par des thymines. En outre, comme décrit dans l’étape 5, les cytosines multiples dans une fenêtre active devraient être soigneusement analysées pour évaluer la fonction des variantes BRCA1.

L’une des étapes les plus importantes est la transfection dans la lignée cellulaire cible, qui affecte la fréquence initiale de mutation pour les évaluations fonctionnelles BRCA1. Pour améliorer la fréquence initiale de mutation, les chercheurs devraient optimiser les méthodes de livraison à la ligne d’intérêt cellulaire. Tel que décrit dans l’étape 1, la génération de BE3 exprimant les lignées cellulaires est une option utile pour augmenter la fréquence initiale de mutation. Nous ne recommandons pas la transduction lentiviral de gRNA dans les cellules HAP1-BE3, parce que l’expression constitutive du BE3 et du gRNA pourrait causer la conversion cumulative de nucléotide, et ces résultats interfèrent avec l’évaluation fonctionnelle des variantes brca1.

En plus des méthodes médiatisées BE3 introduites dans ce protocole, plusieurs méthodes complémentaires sont recommandées pour étendre davantage les évaluations fonctionnelles des variantes BRCA1. Tout d’abord, comme décrit ci-dessus, la fréquence de mutation dans l’échantillon initial est importante afin d’obtenir des résultats confiants des variantes BRCA1. Pour augmenter l’efficacité de l’édition de base, des variantes des éditeurs de base de cytosine, tels que BE4max, sont recommandées. Deuxièmement, le BE3 reconnaît la séquence d’ADN cible à travers les séquences PAM de 5'-NGG-3', ce qui est une limitation dans la génération de divers types de variantes BRCA1. Les variantes Cas9 récemment développées avec des séquences PAM modifiées sont une option utile dans ce cas pour étendre les variantes BRCA1 cibles 26,27,28. Troisièmement, le BE3 induit une modification substantielle de la base sur les sites indésirables et l’effet hors cible pourrait influencer l’évaluation fonctionnelle des variantes BRCA129,30,31. Pour réduire l’effet hors cible du BE3, les sites cibles des ARN doivent être soigneusement choisis sans séquences similaires dans le génome. SECURE-BE3 ou YE1, qui s’est développé pour réduire l’édition de base indésirable dans le génome et le transcriptome sont utiles option32,33. Forth, une méthode d’édition du génome de saturation (SGE) basée sur le HDR à base de Cas9, offre également d’excellentes options pour l’analyse fonctionnelle des variantes BRCA119. La méthode n’a aucune limite pour sélectionner les séquences cibles et les positions nucléotides des variantes BRCA1. Toutefois, l’approche basée sur le HDR est relativement moins efficace que les éditeurs de base et nécessite en outre la conception et la synthèse des modèles de donateurs14. Enfin, les variantes BRCA1 dérivées du patient incluent diverses gammes de mutations telles que des mutations ponctuelles, des insertions, et des suppressions. De ce nombre, les mutations ponctuelles sont une population importante de variantes BRCA1, qui ne sont pas seulement des conversions C:G à T:A, mais aussi des conversions A:T à G:C, C:G à G:C et A:T à T:A. Pour les évaluations fonctionnelles de ces types de conversions, les éditeurs de base d’adénosine à base de CRISPR et les rédacteurs principaux sont des optionsprécieuses 34,35. Le développement rapide de technologies d’ingénierie génomique permettra d’évaluer fonctionnellement des variantes BRCA1 plus diversifiées.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par la National Research Foundation of Korea (subventions 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, et 2018R1A5A2020732 à Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

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Cancer Research Numéro 168 CRISPR-Cas édition de base BE3 BRCA1 évaluation fonctionnelle Ingénierie du génome
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