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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Funktionsbewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-mediated Base Editors

Published: February 28, 2021 doi: 10.3791/61557
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biomedical Sciences, Asan Medical Institute of Convergence Science and Technology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 2Stem Cell Immunomodulation Research Center, University of Ulsan College of Medicine

Summary

Menschen mit BRCA1-Mutationen haben ein höheres Risiko, an Krebs zu erkranken, was eine genaue Bewertung der Funktion von BRCA1-Varianten rechtfertigt. Hierin haben wir ein Protokoll zur funktionellen Bewertung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditoren beschrieben, die eine gezielte Konvertierung von C:G in T:A in lebenden Zellen ermöglichen.

Abstract

Jüngste Studien haben die Risiken im Zusammenhang mit BRCA1-Genmutationen mit verschiedenen funktionellen Bewertungsmethoden wie fluoreszierenden Reporter-Assays, embryonalen Stammzell-Viability-Assays und therapeutischen medikamentenbasierten Sensitivitätstests untersucht. Obwohl sie viele BRCA1-Varianten geklärt haben, sind diese Assays, die die Verwendung exogen ausgedrückter BRCA1-Varianten beinhalten, mit Überexpressionsproblemen verbunden und können nicht auf posttranskriptionelle Regulierung angewendet werden. Um diese Einschränkungen zu beheben, berichteten wir zuvor über eine Methode zur funktionellen Analyse von BRCA1-Varianten über den CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditor, die eine gezielte Nukleotidsubstitution in lebenden Zellen induzieren. Mit dieser Methode identifizierten wir Varianten, deren Funktionen mehrdeutig bleiben, einschließlich c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T und c.4986+5G>A, und bestätigten, dass CRISPR-vermittelte Basiseditoren nützliche Werkzeuge sind, um die in BRCA1unsicheren Varianten der Bedeutung neu zu klassifizieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur funktionstüchchenanalyse von BRCA1-Varianten mit DEM CRISPR-basierten Cytosin-Basiseditor. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Auswahl von Zielstandorten, die Funktionsanalyse und Bewertung von BRCA1-Varianten.

Introduction

Das Brustkrebstyp-1-Anfälligkeitsgen (BRCA1) ist ein weithin bekanntes Tumorsuppressorgen. Da das BRCA1-Gen mit der Reparatur von DNA-Schäden zusammenhängt, würden Mutationen in diesem Gen zu einem höheren Risiko für die Krebsentwicklung bei einem Individuum führen1. Brust-, Eierstock-, Prostata- und Bauchspeicheldrüsenkrebs sind mit vererbten Funktionsverlustmutationen (LOF) des BRCA1-Gens 2verbunden. Die funktionelle Bewertung und Identifizierung von BRCA1-Varianten kann bei der Prävention und Diagnose der verschiedenen Krankheiten helfen. Um die Funktion von BRCA1-Varianten zu adressieren, wurden verschiedene Methoden entwickelt und breit zur Untersuchung der Pathogenität von BRCA1-Varianten wie embryonalen Stammzell-Viability-Assays, fluoreszierenden Reporter-Assays und therapeutischen drogenbasierten Sensitivitäts-Assays3,4,5,6verwendet. Obwohl diese Methoden die Funktion vieler BRCA1-Varianten bewertet haben, stellen die Methoden mit exogen exogen exzessiv ausgedrückten BRCA1-Varianten Einschränkungen in Bezug auf Überexpression dar, die die nachgelagerte Regulierung, Gendosierung und Proteinfaltung beeinträchtigen könnten7. Darüber hinaus können diese Assays nicht auf die posttranskriptionelle Regulierung wie mRNA-Spleißen, Transkriptionstabilität und Wirkung der unübersetzten Region8,9genutzt werden.

CRISPR-Cas9 System ermöglicht gezielte Genombearbeitung in lebenden Zellen und Organismen10. Durch eine Single-Guide-RNA kann Cas9 Doppelstrangbrüche (DSBs) in der chromosomalen DNA an bestimmten genomischen Loci induzieren, um zwei DNA-Reparaturpfade zu aktivieren: fehleranfällige nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und fehlerfreie Homologie-gesteuerte Reparatur (HDR)11. HDR ist ein präziser Reparaturmechanismus; DSBs, die durch Cas9-Nuklease für HDR induziert werden, führen jedoch häufig zu unerwünschter Insertion und Deletion (Indel) Mutation. Darüber hinaus benötigt es homologe Spender-DNA-Vorlagen für die Reparatur von DNA-Schäden und hat eine relativ geringe Effizienz. Kürzlich wurden Cas9-Nickase (nCas9) mit Cytidin-Deaminase-Domänen für die Ausrichtung von C:G bis T:A-Substitutionen verschmolzen, ohne dass homologe DNA-Vorlagen und DNA-Doppelstrangbrüche12,13,14,15. Mit dem Cytosin-Basiseditor haben wir eine neue Methode zur funktionstüchchenden Analyse der BRCA1-Varianten16entwickelt.

In dieser Studie verwendeten wir CRISPR-vermittelten Cytosin-Basiseditor, BE314, der effiziente C:G- bis T:A-Punktmutationen induziert, für die Implementierung der funktionellen Bewertung von BRCA1-Varianten und identifizierten erfolgreich die Funktionen mehrerer BRCA1-Varianten (Abbildung 1).

Figure 1
Abbildung 1: Eine Übersicht über den Workflow für die funktionale Bewertung. (A) Schema, das die funktionelle Bewertung von BRCA1zeigt. Da die LOF von BRCA1 die Zelllebensfähigkeit beeinflusst, sterben die Zellen ab, wenn die BRCA1-Mutation pathogen ist, wenn die Durchgangszahl zunimmt. (B) Phasen der funktionellen Bewertung von BRCA1. Gepunktete Box ist optional. Es kann durch Ko-Transfektion von gRNA-Exzess und BE3-exemittiert Erdplasmiden DNA ersetzt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protocol

HINWEIS: Methode 1 (Erzeugung von HAP1-BE3-Zelllinien) ist optional. Anstatt eine BE3-exemittierende Zelllinie zu konstruieren, kann BE3-kodierende Plasmid-DNA mit gRNA-kodierender Plasmid-DNA kotransfiziert werden. Andere Varianten von Cytosin-Basis-Editoren, wie BE4max, können auch für eine hocheffiziente Basisbearbeitung verwendet werden.

1. Erzeugung von HAP1-BE3-Zelllinien

  1. Aufbau von Plasmid-DNA
    1. Um die lentiBE3-blast Plasmid-DNA für die Lentivirus-Produktion zu konstruieren, verstärken Sie die BE3-Codierungssequenzen in pCMV-BE3 (Materialtabelle) durch PCR mit High-Fidelity-Polymerase. Entwerfen Sie den PCR-Primer so, dass sie überlappende Sequenzen des verdauten Vektors (ab Schritt 1.1.2) für die isotherme Baugruppe wie folgtenthält:
      Grundierung-F: 5'-TTTGCCGCGAGAACACAGGGGGGTTCTAGA GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3',
      Primer-R: 5'-CAGAGAGAAGTTTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTTCTTCTTGGG-3'
      HINWEIS: Nukleotide, die unterstrichen dargestellt werden, überlappen sich mit dem verdauten Vektor, und diese Sequenzen sind spezifisch für den vom Benutzer gewählten Zielvektor.
    2. Digest lentiCas9-blast (Materialtabelle) Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI (1 Einheit pro 1 g) für 1 h bei 37 °C. Führen Sie das verdaute Produkt auf einem 0,8% Agarose-Gel aus und reinigen Sie die entsprechenden Bänder (8,6 kb) mit einem kommerziellen Gelextraktionskit (Tabelle der Materialien).
    3. Klonen Sie das verstärkte BE3 PCR Produkt und verdaut lentiCas9-Blast Vektor mit dem isothermen Montage-Kit (Tabelle der Materialien). Verwenden Sie insgesamt 0,02-0,5 pmol DNA-Fragmente und ein Verhältnis von 1:3 von vector:insert. Verwandeln Sie das Montageprodukt in DH5 alpha-kompetente Zellen18. Fügen Sie die Transformanten auf eine Agarplatte, die Ampicillin (100 g/ml) enthält, und brüten Sie die Platte über Nacht bei 37 °C ein.
    4. Wählen Sie mehrere Kolonien und impfen Sie sie in 4 ml LB (Lysogeny-Brühe) Medium mit Ampicillin (100 g/ml) und wachsen Sie die Kultur in einem schütteren Inkubator bei 180 U/min.
    5. Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Plasmid-DNA-Reinigungskit (Materialtabelle) nach den Protokollen des Herstellers.
    6. Um den Erfolg des DNA-Klonens zu bestätigen, analysieren Sie die BE3-Sequenzen jeder gereinigten Plasmid-DNA (ab Schritt 1.1.5) durch Sanger-Sequenzierung mit Standard- und BE3-spezifischen Primern (Ergänzende Tabelle 1) und wählen Sie das exakt geklonte lentiBE3-blast-Konstrukt aus.
      HINWEIS: Um die Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung zu analysieren, haben wir mehrere Werkzeuge wie BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) und CLUSTALW (https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) empfohlen.
  2. Zellkultur und Generierung von HAP1-BE3-Zelllinien
    1. Bewahren Sie Zellen in einem gesunden Zustand und in einem aktiv teilenden Zustand. Kultur HAP1-Zellen in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (Materialtabelle), das 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin enthält. Kultur HEK293T/17 Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Materialtabelle) mit 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin.
      HINWEIS: HAP1-Zelle ist nützlich für die genetische Forschung, weil es fast haploide Zellen ist. Die Zellen können jedoch spontan in einen diploiden Zustand in der Zellkultur zurückkehren. Anreicherung Hoechst 34580 gefärbt 1n-Population mit Flowzytometrie wird hilfreich für die Aufrechterhaltung der Haploidie von HAP1-Zellen19sein.
    2. Samen 5 x 106 HEK293T/17 Zellen auf einer 100 nm Schale 1 Tag vor der Transfektion. Am Tag der Transfektion die Plasmid-DNA (15 g lentiBE3-blast, 9 g psPAX2 für virale Verpackungen und 6 g pMD2.G für Fläschhunderteumschlag der2. Generation des lentiviralen Verpackungssystems) mit kommerziellen Transfektionsreagenzien gemäß den Protokollen des Herstellers (Materialtabelle)20. Ändern Sie das Medium bei 6 h nach der Transfektion und ernten Virus-haltiges Medium bei 48 h oder 72 h nach der Transfektion. Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45-m-Filter.
    3. Transduce die lentiviralen Partikel von BE3 in HAP1-Zellen bei einem MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1. Um sich auf ein geeignetes MOI einzustellen, verwenden Sie seriell verdünnte Viruskonzentrationen. Entfernen Sie das Medium und ersetzen Sie es durch angepasste virale Überstand und frische Kultur Medium.
    4. Einen Tag nach der Transduktion das Medium blasticidin (Materialtabelle) auf 10 g/ml verstärken und die transduced Zellen für 3 Tage mit Blasticidin auswählen. Wählen Sie nach der Blasticidin-Auswahl für den nächsten Schritt einen Brunnen mit 10 % der überlebenden Zellen aus.
    5. Nach der Blasticidin-Auswahl säen Sie die transduzierten Zellen auf 96-Well-Platten mit einer Dichte von 0,5 Zellen/Well, um einzelne Klone zu isolieren (z. B. verdünnen Sie 50 Zellen in 20 ml (0,5 Zellen pro 200 l) Kulturmedium und aliquot 200 l pro Brunnen in 96 Well-Platte). Inkubieren Sie die 96-Well-Platten für 2 Wochen und wählen Sie die einzelnen Kolonien, um die BE3-Aktivität zu bestätigen.
    6. Teilen Sie die einzelnen Kolonien in zwei Sätze auf, einen Satz zum Testen der BE3-Aktivität und einen anderen für die Wartung. Transduce die lentiviralen Partikel von gRNAs in einen der Sets, um die BE3-Aktivität zu bestätigen. Analysieren Sie die Mutationshäufigkeit jeder Kolonie mit T7-Endonuklease I (T7E1, Tabelle der Materialien) Assay oder durch Die Durchführung der gezielten tiefen Sequenzierungstechnik (Schritt 4)21. Wählen Sie die entsprechenden Einzelklone aus, die fehlerfrei sind und über ein hochaktives BE3 verfügen.
      HINWEIS: Um genaue Mutationsfrequenzen zu validieren, empfehlen wir die gezielte tiefe Sequenzierung als T7E1-Assay. HEK2 (5'-GAACACAAAGCATAGACTGCGGG-'3) ist eine gut validierte Zielseite für BE3.

2. Entwurf und Bau von BRCA1-Targeting-gRNAs

Figure 2
Abbildung 2: Ein Beispiel für eine gRNA-Plasmid-DNA. (A) Um die Zielsequenz mit BE3 effektiv zu bearbeiten, ist ein NGG PAM (CCN PAM) erforderlich, das das Ziel C (Ziel G) innerhalb eines Fünf-Nukleotid-Fensters platziert. NGG PAM wird rot dargestellt und das Basisbearbeitungsfenster wird durch ein graues Feld dargestellt. (B) Die gRNA-Sequenz für c.8047C>T (H1283Y) Basisbearbeitung wird angezeigt und die Ziel-C:G-Paare werden rot angezeigt, während das aktive Fenster durch ein graues Feld hervorgehoben wird. Beim gRNA-Klonen werden die in Fett angegebenen Überhangsequenzen an beiden 5ʹ Enden addiert. Vorlagen für gRNA wurden durch Glühen der beiden komplementären Oligonukleotide erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

HINWEIS: Positive und negative Kontrollen von BRCA1-Varianten sind unerlässlich. In dieser Studie werden c.5252G>A (R1751Q) und c.4527C>T (Y1509Y) als gutartige Kontrollen verwendet. c.191G>A (C64Y), 81-1G>A und c.3598C>T (Q1200*) werden als pathogene Kontrollen verwendet. Die Zielsequenzen jeder gRNA sind in der Ergänzenden Tabelle 1aufgeführt.

  1. Erhalten Sie die BRCA1-Genomsequenz von GenBank unter NCBI22.
  2. Durchsuchen Sie die 20-bp-Ziel-Sites mit der Protospacer Adjacent Motif (PAM) Sequenz "NGG" und "CCN" um Mutation von Interesse. Die Mutation des Interesses sollte sich in 4-8 Nukleotiden im PAM-distalen Ende der gRNA-Zielsequenzen befinden, da das aktive Fenster von BE3 4–8 Nukleotide im PAM-distalen Ende der gRNA-Zielsequenzen14beträgt. Bei c.8047C>T (H1283Y)- und c.5252G>A (R1751Q)-Targeting gRNAs, 5ʹ-TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3ʹ und 5ʹ-CCA-CCAAGGTCCAAAAGCGAGCAA-3ʹ sind die Sequenzen in Fettdruck aktive Fenster. C-T- und G-in-A-Konvertierungen erfolgen mit NGG bzw. CCN PAM (Abbildung 2A).
    HINWEIS: BE-Designer (http://www.rgenome.net/be-designer/)23 ist ein nützliches webbasiertes Werkzeug für das gRNA-Design.
  3. Bestellen Sie zwei komplementäre Oligonukleotide pro gRNA; Fügen Sie für die Vorwärtsoligonukleotide "CACCG" zum 5ʹ Ende der Führungssequenz hinzu, und fügen Sie für die umgekehrten Oligonukleotide "AAAC" am 5'-Ende und "C" am Ende der 3' hinzu. Diese zusätzlichen Sequenzen sind spezifisch für den für dieses Protokoll verwendeten Ziel-gRNA-Expressionsvektor (ab Schritt 2.5), und Benutzer sollten für alternative gRNA-Expressionsvektoren angepasst werden (Abbildung 2B).
  4. Setzen Sie das Oligonukleotid in destilliertem Wasser in einer Endkonzentration von 100 m wieder auf. Mischen Sie die beiden komplementären Oligonukleotide mit T4 Ligationspuffer(Materialtabelle)auf eine Endkonzentration von 10 m und erhitzen Sie sie bei 95 °C für 5 min und kühlen Sie sie bei Raumtemperatur zum Glühen.
  5. Digest pRG2 mit dem Restriktionsenzym BsaI (1 Einheit pro 1 g) für 1 h bei 37 °C (Materialtabelle). Führen Sie das verdaute Produkt auf 1% Agarose-Gel aus und reinigen Sie das entsprechende Band (2,5 kb).
    HINWEIS: Anstatt eine klassische Verdauungs- und Ligationsmethode zu verwenden, kann andere Klonverfahren wie golden gate Klonen verwendet werden.
  6. Ligate das geglühte Oligonukleotid-Duplex mit der gekauften DNA Ligase (Tabelle der Materialien) nach dem Herstellerprotokoll und transformieren sie in DH5 alpha-kompetente Zellen (Andere E. coli-Stämme, die weit verbreitet für subklonierend verwendet werden können).
  7. Fügen Sie die Transformanten zu einer Agarplatte hinzu, die Ampicillin (100 g/ml) enthält, und brüten Sie die Platte über Nacht bei 37 °C. Reinigen Sie Plasmid-DNA von mehreren Transformationsmitteln und analysieren Sie ihre gRNA-Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung mit Primern, die bei U6-Promotor(Tabelle der Materialien) grundieren.

3. Erstellung von BRCA1-Varianten mit CRISPR-vermittelten Basisbearbeitungswerkzeugen

HINWEIS: Wenn HAP1-BE3-Zelllinien nicht verwendet werden, kann BE3-kodierende Plasmid-DNA mit BRCA1-TargetinggRNA kotransfiziert werden. Im Vergleich zur Co-Transfektion von BE3- und gRNA-Plasmiden induziert die Transfektion von gRNA-Plasmid in HAP-BE3-Zellen eine effiziente Basisbearbeitung bis zu 3-fach am Zielort in unseren Händen.

  1. Samen 5 x 105 HAP1-BE3-Zellen (oder HAP1-Zellen bei Co-Transfektionsmethoden) pro Brunnen in 24-Well-Platten 1 Tag vor der Transfektion. Zum Zeitpunkt der Transfektion erreichen Kulturzellen eine angemessene Dichte (70%–80% Zusammenfluss).
  2. Transfekte BRCA1-Targeting gRNAs mit den gekauften Transfektionsreagenzien (Tabelle der Materialien) nach dem Herstellerprotokoll. Verwenden Sie 1 g BRCA1-Targeting-gRNAs (mit 1 g BE3-kodierender Plasmid-DNA bei Co-Transfektionsmethoden), um c:G in T:A-Konvertierung an BRCA1-Zielstandorten zu induzieren. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und Subkultur alle 3–4 Tage.
  3. Ernten Sie die Zellpellets 3, 10 und 24 Tage nach der Transfektion, um die Effizienz der Basisbearbeitung zu analysieren (Proben von 3 Tagen nach der Transfektion werden als Tag 0-Proben analysiert).
  4. Extrahieren Sie genomische DNA mit dem genomischen DNA-Reinigungskit (Tabelle der Materialien).
    HINWEIS: Wir empfehlen, transfektionsbedingungen mit einem variablen Verhältnis von Reagenz zu DNA zu optimieren. Optimaler Zustand für die HAP1-Transfektion ist 4:1 Ration des Reagenzes zur DNA in unseren Händen.

4. Beispielvorbereitung für Illumina Next-Generation-Sequenzierung (NGS)

Figure 3
Abbildung 3: Vorbereitung für die Sequenzierung der nächsten Generation. Die1. PCR-Grundierung wurde entwickelt, um die BRCA1-Zielstelle auf genomische DNA zu verstärken. Der2. PCR-Primer wurde so konzipiert, dass seine Sequenzen mehr im Inneren als die 1st PCR Primer-Sequenzen liegen. Zusätzliche Sequenzen, die als gelber Balken angezeigt werden, wurden an beiden Enden des2. PCR-Primers hinzugefügt, um die wesentlichen Sequenzen für die Sequenzierung der nächsten Generation anzuhängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Entwerfen Sie die 1st PCR-Primer, um BRCA1-Zielstandorte zu erweitern. Obwohl es keine Beschränkung auf die Größe des1. PCR-Produkts gibt, wird eine Produktgröße von <1 kb empfohlen, um eine bestimmte Region effizient zu verstärken (Abbildung 3).
  2. Entwerfen Sie die2. PCR-Grundierungen innerhalb des 1st PCR-Produkts. Betrachten Sie die Größe des Amplicons entsprechend der NGS-Leselänge (Z. B. sollte die Größe des Amplicon-Produkts kleiner als 300 bp für 2 × 150 bp paired-end-Run sein, um jeden Lesevorgang zusammenzuführen). Um wesentliche Sequenzen für die NGS-Analyse beizufügen, fügen Sie dem 5' Ende der2. PCR-Grundierung zusätzliche Sequenzen wie folgt hinzu: Für die Vorwärtsprimer 5'-ACACTCTCTCTCTTACACGACGCTCCT-3' Sequenzen zum 5'-Ende hinzufügen, und für die Reverse Primer 5'-GTGACTGGAGCTAGACAC
    HINWEIS: Wir haben geschachtelte PCR verwendet, um das Amplicon unspezifischer Bindung zu reduzieren, indem verhindert wurde, dass Primer an eine Nicht-Zielsequenz angefügt werden.
  3. Amplizifizieren Sie die BRCA1-Zielstellen auf der genomischen DNA, die aus drei Zeitpunkten gewonnen wird. Verwenden Sie High-Fidelity-Polymerase gemäß dem Herstellerprotokoll zur Minimierung von PCR-Fehlern. Für die1. PCR-Reaktion verwenden Sie 100 ng genomische DNA für die Amplifikation über 15 Zyklen. Für die2. PCR-Reaktion verwenden Sie 1 l des1. PCR-Produkts für die Verstärkung über 20 Zyklen. Führen Sie 5 l des2. PCR-Produkts auf 2% Agarose-Gel aus und bestätigen Sie die Größe.
  4. Um die wesentlichen Sequenzen für die NGS-Analyse zu befestigen, verstärken Sie das2. PCR-Produkt mit den unten aufgeführten Primern. Für die PCR-Reaktion wird 1 l des2. PCR-Produkts zur Verstärkung von bis zu 30 Zyklen mit High-Fidelity-Polymerase verwendet.
    1. Um multiplexe Sequenzierung für eine große Anzahl von Bibliotheken durchzuführen, die gleichzeitig gepoolt und sequenziert werden sollen, verwenden Sie Vorwärts-Primer (D501 – D508) und Reverse -Primer (D701 – D712), die über eine eindeutige Indexsequenz verfügen (Zusatztabelle 1). Verstärken Sie jedes Beispiel mit verschiedenen Primer-Sets, um die einzigartige duale Indexierungsstrategie durchzuführen.
    2. Führen Sie 5 l des PCR-Produkts auf 2% Agarose-Gel aus, um die Größe zu bestätigen, und reinigen Sie das Amplicon mit einem kommerziellen PCR-Reinigungskit(Tabelle der Materialien). Mischen Sie jedes Beispiel in gleichen Mengen, um eine NGS-Bibliothek zu erstellen.
  5. Quantifizieren Sie die NGS-Bibliothek bei 260 nm Wellenlänge mit Spektralphotometern und verdünnen Sie die NGS-Bibliothek mit einer Konzentration von 1 nM mit Resuspensionspuffer oder 10 mM Tris-HCl, pH 8,5. Bereiten Sie 100 l der Bibliothek auf die entsprechende Belastungskonzentration je nach Bibliothekstypen verdünnt (z. B. 200 pM der Bibliothek für Nextera DNA Flex vorbereiten).
    1. Kombinieren Sie als Kontrolle phiX mit der verdünnten Probe, die für den Typ des Kits geeignet ist.
    2. Laden Sie die Bibliothek auf die Kassette und führen Sie NGS gemäß dem Herstellerprotokoll aus. Illumina iSeq 100 oder Miseq Systeme können die Amplicons mit verschiedenen Längen bis zu 300 bp für Single-Read oder gekoppeltes Ende sequenzieren. Wir haben über 10.000 Lesevorgänge pro Zielamplikon für eine gründliche Analyse der Basisbearbeitungseffizienz empfohlen.

5. Analyse der Basis-Editing-Effizienz für die funktionale Bewertung von BRCA1-Varianten

  1. Analysieren Sie die Effizienz der Basisbearbeitung mit MAUND24. Die Basisbearbeitungseffizienz wird wie unten beschrieben berechnet.
    Equation 1
    Wenn mehrere Zytosine im aktiven BE3-Fenster vorhanden sind, wird nur die Konvertierung C in T berücksichtigt, die für die Bewertung der BRCA1-Variante vorgesehen ist. Wenn z. B. die Sequenzen des aktiven BE3-Fensters "C4A5T6C7T8" sind,sind die möglichen Sequenzen, die durch Basisbearbeitung generiert werden, "T4A5T6C7T8", "C4A5T6T7T8" und "T4A5T6T7T8". Wenn Position 4 die Zielposition für die gewünschte BRCA1-Variante ist, wird zu diesem Zeitpunkt nur die Sequenz ""T4A5T6C7T8" für die Berechnung der Basisbearbeitungseffizienz berücksichtigt.
    HINWEIS: Wir empfehlen auch andere Web-Tools für die Analyse von Basis-Editing-Aktivitäten wie CRISPResso225und BE-Analyzer23.
  2. Überprüfen Sie die Ergebnisse mit positiven und negativen Kontrollen von BRCA1-Varianten. Die Effizienz der Basisbearbeitung der gutartigen Kontrolle sollte gleich bleiben, während die der pathogenen Kontrolle im Laufe der Zeit abnehmen sollte.
  3. Berechnen Sie die relative Basisbearbeitungseffizienz von BRCA1-Varianten und bestimmen Sie deren Pathogenität. Die signifikanten Unterschiede zwischen Tag 0 und Tag 21 Proben werden entsprechend einer statistischen Analyse wie z.B. t-test analysiert.

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Representative Results

Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Ansätze ermöglichen die funktionelle Bewertung endogener BRCA1-Varianten, die von CRISPR-basierten Cytosin-Basiseditoren generiert werden. Um geeignete Zelllinien für die funktionelle Bewertung von BRCA1-Varianten auszuwählen, sollten die Forscher bestätigen, dass BRCA1 ein wesentliches Gen in den Zielzelllinien ist. Zum Beispiel transfizierten wir zuerst Cas9 und gRNAs in HAP1-Zelllinien, um BRCA1 zu stören, und analysierten Mutationsfrequenzen durch gezielte tiefe Sequenzierung. Wir fanden heraus, dass die Mutationshäufigkeiten im Laufe der Zeit in HAP1-Zelllinien signifikant abnahmen (Abbildung 4A). Diese Ergebnisse zeigten, dass BRCA1 ein wesentliches Gen für die Zelllebensfähigkeit in HAP1-Zelllinien ist. Um zu untersuchen, ob C:G bis T:A substituierte Varianten die Funktion von BRCA1beeinflussen, wurden die Plasmide, die gRNAs kodieren, die jede Mutation induzieren könnten, in HAP1-BE3-Zelllinien transfiziert und die Substitutionsfrequenzen analysiert. Die relativen Substitutionsfrequenzen von ca.3598C>T (p. Q1200*), einer pathogenen Variante, nahmen dramatisch ab, während die von c.4527C>T (p.Y1509Y), einer gutartigen Variante, mit der Zeit ähnlich blieben(Abbildung 4B). In der ClinVar-Datenbank werden c.154C>T (p. L52F), c.3847C>T (p.H1283Y) und c.5056C>T (p.H1686Y) von BRCA1 als Varianten von ungewisser Bedeutung gemeldet. Wir analysierten die Funktion dieser Varianten mit den oben genannten Methoden und fanden heraus, dass die Nukleotidsubstitutionsfrequenzen dieser drei Varianten zeitabhängig abnahmen (Abbildung 4B). Aus diesen Ergebnissen veränderten die drei Substitutionen die BRCA1-Funktion und konnten als pathogene Mutationen kategorisiert werden.

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der funktionellen Studie von BRCA1 mit CRISPR-Cas9-Systemen. (A) BRCA1-Störung wirkt sich auf die Zelllebensfähigkeit aus. HAP1-Zellen wurden mit Plasmid-Codierung spCas9 und zwei gRNAs für BRCA1transfiziert, und gezielte tiefe Sequenzierung wurde für die Zelllebensfähigkeitsanalyse durchgeführt. Mutationsfrequenzen von BRCA1 verringerten sich zeitabhängig in Zellen, die mit zwei unabhängigen gRNAs transfiziert wurden, und die Mutationsfrequenzen von CCR5, die als Negativkontrolle verwendet wurde, blieben im Laufe der Zeit gleich. (B) Funktionsbeurteilungen von fünf BRCA1-Varianten. HAP1-BE3-Zellen wurden mit gRNAs transfiziert, die BRCA1-Mutationen induzieren, und für die Zelllebensfähigkeitsanalyse wurde eine gezielte tiefen Sequenzierung durchgeführt. Die relativen Substitutionsfrequenzen verringerten sich zeitabhängig in Zellen von c.3598C>T, c.154C>T, c.3847C>T und c.5056C>T und denen von c.4527C>T blieben gleich. Fehlerbalken zeigen den Standardfehler des Mittelwerts an. Sternchen bezeichnen unterschiedliche P-Werte: * P<0.05; ** P<0.005., n.s: nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für funktionale Bewertungen von BRCA1-Varianten mit DEM CRISPR-meditierten Cytosin-Basiseditor. Das Protokoll beschreibt Methoden für die Konstruktion von gRNAs am Zielort und die Konstruktion der Plasmid-DNAs, aus denen sie exprimiert werden. Cytosin-Basis-Editoren induzieren Nukleotid-Konvertierung in einem aktiven Fenster (bei BE3 Nukleotide 4–8 im PAM-distalen Ende der gRNA-Zielsequenzen). Der Forscher sollte sorgfältig Zielsequenzen auswählen, da alle Zytosine im aktiven Fenster durch Thyininersetzt ersetzt werden können. Darüber hinaus sollten, wie in Schritt 5 beschrieben, mehrere Zytosine in einem aktiven Fenster sorgfältig analysiert werden, um die Funktion von BRCA1-Varianten zu bewerten.

Einer der wichtigsten Schritte ist die Transfektion in der Zielzelllinie, die sich auf die anfängliche Mutationshäufigkeit für BRCA1-Funktionsbewertungen auswirkt. Um die anfängliche Mutationshäufigkeit zu verbessern, sollten die Forscher die Verabreichungsmethoden an die Zelllinie von Interesse optimieren. Wie in Schritt 1 beschrieben, ist die Erzeugung von BE3-exemittierungszelllinien eine nützliche Option, um die anfängliche Mutationshäufigkeit zu erhöhen. Wir empfehlen keine lentivirale Transduktion von gRNA in die HAP1-BE3-Zellen, da die konstitutive Expression von BE3 und gRNA eine akkumulative Nukleotidumwandlung verursachen könnte, und diese Ergebnisse stören die funktionelle Bewertung von BRCA1-Varianten.

Zusätzlich zu den in diesem Protokoll eingeführten BE3-vermittelten Methoden werden mehrere ergänzende Methoden empfohlen, um die funktionellen Bewertungen von BRCA1-Varianten weiter zu erweitern. Erstens ist, wie oben beschrieben, die Mutationshäufigkeit in der Ausgangsstichprobe wichtig, um sichere Ergebnisse von BRCA1-Varianten zu erhalten. Um die Basisbearbeitungseffizienz zu erhöhen, werden Varianten von Cytosin-Basis-Editoren wie BE4max empfohlen. Zweitens erkennt die BE3 die Ziel-DNA-Sequenz durch die 5'-NGG-3' PAM-Sequenzen, was eine Einschränkung bei der Generierung verschiedener Arten von BRCA1-Varianten darstellt. Kürzlich entwickelte Cas9-Varianten mit veränderten PAM-Sequenzen sind in diesem Fall eine nützliche Option, um zielfähige BRCA1-Varianten 26,27,28zu erweitern. Drittens induziert der BE3 eine umfangreiche Basisbearbeitung an unerwünschten Standorten und der Off-Target-Effekt könnte die funktionale Bewertung der BRCA1-Varianten29,30,31beeinflussen. Um den Off-Target-Effekt von BE3 zu reduzieren, sollten Zielstandorte von gRNAs sorgfältig ohne ähnliche Sequenzen im Genom ausgewählt werden. SECURE-BE3 oder YE1, das zur Reduzierung unerwünschter Basisbearbeitung im Genom und Transkriptom entwickelt hat, sind nützliche Option32,33. Forth, eine Sättigungsgenom-Editing (SGE) Methode auf Basis von Cas9-vermittelte HDR auch große Optionen für die funktionelle Analyse von BRCA1-Varianten19. Die Methode hat keine Einschränkung für die Auswahl von Zielsequenzen und Nukleotidpositionen von BRCA1-Varianten. Der HDR-basierte Ansatz ist jedoch relativ weniger effizient als die Basis-Editoren und erfordert zusätzlich das Design und die Synthese von Spendervorlagen14. Schließlich enthalten die vom Patienten abgeleiteten BRCA1-Varianten verschiedene Mutationen wie Punktmutationen, Einfügungen und Deletionen. Von diesen sind Punktmutationen eine große Population von BRCA1-Varianten, die nicht nur C:G- bis T:A-Konvertierung, sondern auch A:T zu G:C, C:G zu G:C und A:T zu T:A-Konvertierungen sind. Für funktionale Bewertungen dieser Arten von Konvertierungen sind CRISPR-vermittelte Adenosin-Basis-Editoren und Prime-Editoren wertvolle Optionen34,35. Die sich rasch entwickelnden Genom-Engineering-Technologien werden funktionale Bewertungen unterschiedlicher BRCA1-Varianten ermöglichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea unterstützt (Grants 2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637 und 2018R1A5A2020732 an Y.K.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI NEB R3136 Restriction enzyme
Blasticidin Thermo Fisher Scientific A1113903 Drug for selecting transduced cells
BsaI NEB R0535 Restriction enzyme
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504 Genomic DNA prep. kit
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Gibco 11965092 Medium for HEK293T/17 cells
Fetal bovine serum Gibco 16000036 Supplemetal for cell culture
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311 Transfection reagent
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611L Gibson assembly kit
Iscove’s modified Dulbecco’s medium Gibco 12440046 Medium for HAP1 cells
lentiCas9-Blast Addgene 52962 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027 Transfection reagent
Opti-MEM Gibco 31985070 Transfection materials
pCMV-BE3 Addgene 73021 Plasmids DNA for lentiBE3 cloning
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140 Supplemetal for cell culture
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530SQ High-fidelity polymerase
pMD2.G Addgene 12259 Plasmids DNA for virus prep.
pRG2 Addgene 104174 gRNA cloning vector
psPAX2 Addgene 12260 Plasmids DNA for virus prep.
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 Plasmid DNA prep. Kit
QIAquick Gel extraction Kit Qiagen 28704 Gel extraction kit
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 PCR product prep. kit
Quick Ligation Kit NEB M2200 Ligase for gRNA cloning
T7 Endonuclease I NEB M0302 Materials for T7E1 assay
XbaI NEB R0145 Restriction enzyme

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References

  1. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  2. Kuchenbaecker, K. B., et al. Risks of Breast, Ovarian, and Contralateral Breast Cancer for BRCA1 and BRCA2 Mutation Carriers. Journal of the American Medical Association. 317 (23), 2402-2416 (2017).
  3. Millot, G. A., et al. A guide for functional analysis of BRCA1 variants of uncertain significance. Human Mutation. 33 (11), 1526-1537 (2012).
  4. Santos, C., et al. Pathogenicity evaluation of BRCA1 and BRCA2 unclassified variants identified in Portuguese breast/ovarian cancer families. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (3), 324-334 (2014).
  5. Starita, L. M., et al. A Multiplex Homology-Directed DNA Repair Assay Reveals the Impact of More Than 1,000 BRCA1 Missense Substitution Variants on Protein Function. American Journal of Human Genetics. 103 (4), 498-508 (2018).
  6. Anantha, R. W., et al. Functional and mutational landscapes of BRCA1 for homology-directed repair and therapy resistance. Elife. 6, (2017).
  7. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
  8. Quann, K., Jing, Y., Rigoutsos, I. Post-transcriptional regulation of BRCA1 through its coding sequence by the miR-15/107 group of miRNAs. Frontiers in Genetics. 6, 242 (2015).
  9. Saunus, J. M., et al. Posttranscriptional regulation of the breast cancer susceptibility gene BRCA1 by the RNA binding protein HuR. Cancer Research. 68 (22), 9469-9478 (2008).
  10. Knott1, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361, 866-869 (2018).
  11. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  12. Hess, G. T., et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nature Methods. 13 (12), 1036-1042 (2016).
  13. Kim, K., et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature Biotechnology. 35 (5), 435-437 (2017).
  14. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  15. Park, D. S., et al. Targeted Base Editing via RNA-Guided Cytidine Deaminases in Xenopus laevis Embryos. Molecules and Cells. 40 (11), 823-827 (2017).
  16. Kweon, J., et al. A CRISPR-based base-editing screen for the functional assessment of BRCA1 variants. Oncogene. 39 (1), 30-35 (2020).
  17. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).
  18. Nageshwaran, S., et al. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).
  19. Findlay, G. M., et al. Accurate classification of BRCA1 variants with saturation genome editing. Nature. 562 (7726), 217-222 (2018).
  20. Kweon, J., Kim, D. E., Jang, A. H., Kim, Y. CRISPR/Cas-based customization of pooled CRISPR libraries. PLoS One. 13 (6), 0199473 (2018).
  21. Kim, Y., et al. A library of TAL effector nucleases spanning the human genome. Nature Biotechnology. 31 (3), 251-258 (2013).
  22. Sayers, E. W., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 47 (1), 94-99 (2019).
  23. Hwang, G. H., et al. Web-based design and analysis tools for CRISPR base editing. BMC Bioinformatics. 19 (1), 542 (2018).
  24. Kim, D., Kim, D. E., Lee, G., Cho, S. I., Kim, J. S. Genome-wide target specificity of CRISPR RNA-guided adenine base editors. Nature Biotechnology. 37 (4), 430-435 (2019).
  25. Clement, K., et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nature Biotechnology. 37 (3), 224-226 (2019).
  26. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  27. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  28. Walton, R. T., Christie, K. A., Whittaker, M. N., Kleinstiver, B. P. Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. Science. , (2020).
  29. Kim, D., et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature Biotechnology. 35 (5), 475-480 (2017).
  30. Zuo, E., et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science. 364 (6437), 289-292 (2019).
  31. Jin, S., et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice. Science. 364 (6437), 292-295 (2019).
  32. Grunewald, J., et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature. 569 (7756), 433-437 (2019).
  33. Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors. Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).
  34. Gaudelli, N. M., et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 551 (7681), 464-471 (2017).
  35. Anzalone, A. V., et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).

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Krebsforschung Ausgabe 168 CRISPR-Cas Basisbearbeitung BE3 BRCA1 Funktionsbewertung Genomtechnik
Funktionsbewertung von <em>BRCA1-Varianten</em> mit CRISPR-mediated Base Editors
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