إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد
Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى تداعي قلب ورئتي الفئران. يمكن أن تكون سقالات المصفوفة خارج الخلية الناتجة (ECM) ملطخة بالمناعة ومصورة لرسم خريطة لموقع وتضاريم مكوناتها.
Abstract
نقدم هنا بروتوكول التفكيك لقلب الفأر والرئتين. وتنتج سقالات ECM الهيكلية التي يمكن استخدامها لتحليل طوبولوجيا ECM وتكوينها. وهو يقوم على إجراء جراحي دقيق مصمم لقسطرة القصبة الهوائية والأورطة من فأر القتل الرحيم لتشويش القلب والرئتين مع عوامل التفكيك. يمكن أن يكون مجمع القلب الرئوي الديسيلي في وقت لاحق ملطخا بالمناعة للكشف عن موقع بروتينات ECM الهيكلية. يمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 أيام.
سقالات ECM الناتجة عن هذا البروتوكول خالية من التشوهات الأبعاد. غياب الخلايا يتيح الفحص الهيكلي للهياكل ECM وصولا الى قرار submicron في 3D. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة السليمة والمرضية من الفئران التي لا تتجاوز أعمارهم 4 أسابيع ، بما في ذلك نماذج الماوس من التليف والسرطان ، مما يفتح الطريق لتحديد إعادة عرض ECM المرتبطة بمرض القلب والكون.
Introduction
و ECM هي شبكة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من البروتينات والجلوكان التي تستوعب جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا، وإعطاء الأعضاء شكلها وتنظيم سلوك الخلية طوال الحياة1. من تخصيب البويضة فصاعدا، تقوم الخلايا ببناء وإعادة تشكيل ECM، وبالتالي يتم التحكم فيها بدقة من قبلها. الغرض من هذا البروتوكول هو فتح طريقة لتحليل خريطة الفأر ECM ، حيث أن الفئران هي الكائن الحي النموذجي الأكثر استخداما في الفيزيولوجيا المرضية للثدييات.
وكان الدافع وراء تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى توصيف وعزل ECM2 الأصلي المرتبط بالنقائل. نظرا لأن الأورام تفتقر إلى الأوعية الدموية التشريحية المناسبة والفئران هي كائنات صغيرة نسبيا ، فقد تم تصميم الإجراءات الجراحية الدقيقة لقسطرة الشريان الأورطي إلى الوراء ، مع عزل دوران الأوعية الرئيسية المؤدية إلى الورم (على سبيل المثال ، الأوردة الرئوية) ، وبالتالي تركيز تدفق الكاشف والسماح بإزالة الورم. تنتج هذه الطريقة سقالات ECM مع هيكل محفوظ2 يمكن أن يكون ملطخا بالمناعة ومصورا ، مما يسمح برسم خرائط بنية ECM بتفاصيل submicron. لتنفيذ هذا البروتوكول، من الضروري اكتساب المهارات الجراحية والجراحية الدقيقة (تشريح، والتسوية الدقيقة والقسطرة) التي قد تمثل قيدا محتملا على استخدامه. على حد علمنا، تمثل هذه الطريقة أحدث ما في تحليل تصوير بنية ECM الأصلي2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات إزالة الخلايا على أساس هياج الأنسجة تغيير هيكل ECM، مما يجعلها غير مناسبة لتحليل هيكل ECM4. الارتهاق الارتخائي ، باستخدام مسار تشريحي مثل الشريان الأورطي للرغامى ، يسمح بالوصول إلى السرير الشعري ، أو الحويصلات الهوائية الطرفية ، ويسهل تسليم عوامل التفكيك في جميع أنحاء ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور إيفانا نوفاك والدكتورة نين مين كريستنسن (مركز التصوير الحيوي المتقدم (CAB)، جامعة كوبنهاغن) على توفير الوصول إلى المجهر. وقد دعم هذا العمل مجلس البحوث الأوروبي (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN؛ AEM-G، OW، RR و JTE)؛ منحة دكتوراه من مؤسسة لوندبيك (R286-2018-621؛ MR)؛ مجلس البحوث السويدي (2017-03389؛ آلية التنمية النظيفة)؛ الجمعية السويدية للسرطان، Cancerfonden (CAN 2016/783، 19 0632 Pj، 190007؛ آلية التنمية النظيفة)؛ المعونة الألمانية لمكافحة السرطان (دويتشه كريبشيلفي؛ RR)؛ وجمعية السرطان الدنماركية (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
