דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין
Summary
פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.
Abstract
אנו מציגים כאן פרוטוקול דפלולרציה ללב העכבר ולריאות. הוא מייצר פיגומי ECM מבניים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח טופולוגיה והרכב ECM. הוא מבוסס על הליך מיקרו-כירורגי שנועד לצנתר את קנה הנשימה ואת אב העורקים של עכבר מורדם כדי לשוטט בלב ובריאות עם חומרים מנטרלים. קומפלקס קרדיו-ריאות decellularized לאחר מכן ניתן לחסן כדי לחשוף את המיקום של חלבוני ECM מבניים. ניתן להשלים את כל ההליך ב-4 ימים.
פיגומי ECM הנובעים מפרוטוקול זה נקיים מעיוותים ממדיים. היעדר תאים מאפשר בדיקה מבנית של מבני ECM עד לרזולוציית תת-מיקרון בתלת-ממד. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמה בריאה וחולנית מעכברים בגיל 4 שבועות, כולל מודלים עכבר של פיברוזיס וסרטן, פתיחת הדרך כדי לקבוע ECM שיפוץ הקשורים למחלות לב ריאה.
Introduction
ה- ECM היא רשת תלת ממדית העשויה מחלבונים וגליקנים המתאימה לכל התאים באורגניזם רב-תאי, המעניקה לאיברים את צורתם ומווסתת את התנהגות התאים לאורך החיים1. מהפריית ביצית ואילך, תאים בונים ומשפצים את ה- ECM, והם נשלטים בקפדנות על ידי זה. מטרת פרוטוקול זה היא לפתוח דרך לנתח ולמפה את עכבר ECM, שכן עכברים הם האורגניזם המודל הנפוץ ביותר בפתופיזיולוגיה של יונקים.
ההתפתחות של שיטה זו הונעה על ידי הצורך לאפיין ולבודד ECM2 יליד גרורות הקשורים גרורות. כמו גידולים חסרים כלי דם אנטומיים נאותים ועכברים הם אורגניזמים קטנים יחסית, הליכים מיקרוכירורגיים תוכננו כדי להצטמצם בנסיגה של אב העורקים, תוך בידוד זרימת הכלי העיקרי המוביל לגידול (למשל, ורידים ריאתיים), ובכך למקד את זרימת ריאגנט ומאפשר דפלולרציה של הגידול. שיטה זו מייצרת פיגומי ECM עם מבנה שמור2 שניתן לחסן ולדמות, ומאפשרת מיפוי מבנה ECM בפירוט תת-מיקרון. כדי לבצע פרוטוקול זה, יש צורך לרכוש מיומנויות כירורגיות ומיקרוכירורגיות (ניתוח, מיקרו-uturing וצנתור) שעשויים לייצג מגבלה פוטנציאלית לשימוש בו. למיטב ידיעתנו, שיטה זו מייצגת את הארגון החדיש ביותר עבור ניתוח הדמיית מבנה ECM מקורי2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות Decellularization המבוססות על תסיסה רקמה לשנות מבנה ECM, מה שהופך אותם לא מתאים לניתוח מבנה ECM4. דטרמינוליזציה זלוף, באמצעות מסלול אנטומי כגון אב העורקים של קנה הנשימה, מאפשר להגיע למיטה נימי, או alveoli סופני, ומאפשר את המסירה של סוכנים decellularizing ברחבי האיבר. השימוש zwitterionic, אניוני ולא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפרופ’ איוונה נובאק וד”ר נין מיין כריסטנסן (המרכז להנפשה ביולוגית מתקדמת (CAB), אוניברסיטת קופנהגן) על מתן גישה למיקרוסקופ. עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR ו- JTE); מלגת דוקטורט מקרן לונדבק (R286-2018-621; מר); מועצת המחקר השוודית (2017-03389; CDM); האגודה השבדית לסרטן, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, ו- 190007; CDM); סיוע גרמני לסרטן (דויטשה קרבשילפה; RR); והאגודה הדנית לסרטן (R204-A12454; ר.ר).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
