マウス心肺複合体の脱細胞化
Summary
このプロトコルは、マウスの心臓と肺の細胞化を解除することを目的としています。得られた細胞外マトリックス(ECM)足場は、免疫染色され、それらの成分の位置およびトポロジーをマッピングするために画像化することができる。
Abstract
ここでは、マウスの心臓と肺の脱細胞化プロトコルを紹介します。それはECMのトポロジーおよび組成を分析するために使用することができる構造ECM足場を作り出す。これは、心と肺を脱細胞化剤で浸透させるために安楽死マウスの気管および大殿をカテーテルするように設計された微小外科的処置に基づいています。脱細胞化された心肺複合体は、その後、構造ECMタンパク質の位置を明らかにするために免疫染色することができる。全体の手順は、4日で完了することができます。
このプロトコルから生じる ECM スキャフォールドは、寸法の歪みのないものです。細胞の不在により、3Dでのサブミクロン分解能までECM構造の構造検査が可能になります。このプロトコルは、線維症および癌のマウスモデルを含む、生後4週の若いマウスから健康で病気の組織に適用することができ、心肺疾患に関連するECMリモデリングを決定する方法を開く。
Introduction
ECMは、タンパク質とグリカンで構成された3次元ネットワークであり、多細胞生物のすべての細胞を収容し、臓器に形状を与え、生涯を通じて細胞の挙動を調節します1。卵の受精から、細胞はECMを構築し、改造し、順番に厳密に制御されます。このプロトコルの目的は、マウスが哺乳類の病態生理学で最も使用されるモデル生物であるため、マウスECMを分析し、マッピングする方法を開くものです。
この方法の開発は、転移関連のネイティブECM2を特徴付け、分離する必要性によって推進されました。腫瘍は適切な解剖学的血管化を欠き、マウスは比較的小さな生物であるため、大動脈を逆行させるため、大動脈を逆行させるため、腫瘍につながる主要な血管(例えば肺静脈)の循環を単離し、試薬の流れを集中させ、腫瘍脱細胞化を可能にするマイクロ外科的処置を行った。この方法は、免疫染色および画像化することができる保存構造2を有するECM足場を生成し、サブミクロンの詳細でECM構造マッピングを可能にする。このプロトコルを実行するには、その使用に潜在的な制限を表す可能性のある外科的および微小外科的スキル(解剖、顕微鏡およびカテーテル化)を習得する必要があります。我々の知る限りでは、この方法は、ネイティブECM構造イメージング解析2,3の最先端を表しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織撹拌に基づく脱細胞化技術はECM構造を変化させ、ECM構造解析4に不適当にする。輸液脱細胞化は、気管の大器官のような解剖学的経路を用いて、毛細血管床、または末期のアルベオリに到達することを可能にし、器官全体の脱細胞化剤の送達を促進する。ジウテリオニック、アニオン性、非イオン性洗剤を使用して組織を脱細胞化すると報告されています</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、イヴァナ・ノバク教授とニン・メイ・クリステンセン博士(コペンハーゲン大学高度バイオイメージングセンター)に感謝します。この研究は、欧州研究評議会(ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN)によって支援されました。AEM-G、OW、RR、および JTE);ルンドベック財団(R286-2018-621;R286-621)の博士課程のフェローシップMR);スウェーデン研究評議会 (2017-03389;CDM);スウェーデン癌学会, がんフォンデン (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, そして190007;CDM);ドイツ癌援助(ドイツ・クレブシルフェ;RR);デンマーク癌学会 (R204-A12454;RR)。
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
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- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
