Décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin
Summary
Ce protocole vise à décellulariser le cœur et les poumons des souris. Les échafaudages de matrice extracellulaire (ECM) qui en résultent peuvent être immunocolorés et imagés pour cartographier l’emplacement et la topologie de leurs composants.
Abstract
Nous présentons ici un protocole de décellularisation pour le cœur et les poumons des souris. Il produit des échafaudages ECM structurels qui peuvent être utilisés pour analyser la topologie et la composition ECM. Il est basé sur une procédure microchirurgicale conçue pour cathétériser la trachée et l’aorte d’une souris euthanasiée afin de perfuser le cœur et les poumons avec des agents décellularisants. Le complexe cardiopulmonaire décellularisé peut ensuite être immunocoloré pour révéler l’emplacement des protéines ECM structurelles. L’ensemble de la procédure peut être complété en 4 jours.
Les échafaudages ECM résultant de ce protocole sont exempts de distorsions dimensionnelles. L’absence de cellules permet l’examen structurel des structures ECM jusqu’à une résolution submicronique en 3D. Ce protocole peut être appliqué aux tissus sains et malades de souris aussi jeunes que 4 semaines, y compris des modèles murins de fibrose et de cancer, ouvrant la voie à la détermination du remodelage ECM associé à la maladie cardiopulmonaire.
Introduction
L’ECM est un réseau tridimensionnel composé de protéines et de glycanes qui accueille toutes les cellules d’un organisme multicellulaire, donnant aux organes leur forme et régulant le comportement cellulaire tout au long de la vie1. À partir de la fécondation des ovules, les cellules construisent et remodèlent l’ECM, et sont à leur tour strictement contrôlées par celui-ci. Le but de ce protocole est d’ouvrir la voie à l’analyse et à la cartographie de l’ECM de la souris, car les souris sont l’organisme modèle le plus utilisé en physiopathologie des mammifères.
Le développement de cette méthode a été motivé par la nécessité de caractériser et d’isoler l’ECM2 natif associé aux métastases. Comme les tumeurs manquent de vascularisation anatomique appropriée et que les souris sont des organismes relativement petits, les procédures microchirurgicales ont été conçues pour cathétériser rétrogradement l’aorte, tout en isolant la circulation du vaisseau majeur menant à une tumeur (par exemple, les veines pulmonaires), concentrant ainsi le flux de réactif et permettant la décellularisation tumorale. Cette méthode produit des échafaudages ECM avec une structure conservée2 qui peut être immunocolorée et imagée, permettant une cartographie de la structure ECM dans des détails submicroniques. Pour réaliser ce protocole, il est nécessaire d’acquérir des compétences chirurgicales et microchirurgicales (dissection, microsuturing et cathétérisme) qui peuvent représenter une limitation potentielle à son utilisation. À notre connaissance, cette méthode représente l’état de l’art pour l’analyse d’imagerie de structure ECM native2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques de décellularisation basées sur l’agitation tissulaire modifient la structure de l’ECM, ce qui les rend impropres à l’analyse de la structure de l’ECM4. La décellularisation par perfusion, utilisant une voie anatomique telle que l’aorte de la trachée, permet d’atteindre le lit capillaire, ou alvéole terminale, et facilite l’administration d’agents décellularisants dans tout l’organe. L’utilisation de détergents zwittérioniques, anioniques et non ioniques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les professeurs Ivana Novak et Nynne Meyn Christensen (Centre for Advanced Bioimaging (CAB), Université de Copenhague) d’avoir fourni un accès au microscope. Ces travaux ont été soutenus par le Conseil européen de la recherche (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR et JTE); une bourse de doctorat de la Fondation Lundbeck (R286-2018-621; MR); le Conseil suédois de la recherche (2017-03389; MDP); la Société suédoise du cancer, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, et 190007; MDP); Aide allemande contre le cancer (Deutsche Krebshilfe; RR); et la Société danoise du cancer (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
