Децеллюляризация мышиного сердечно-легочного комплекса
Summary
Этот протокол направлен на децеллюляризацию сердца и легких мышей. Полученные каркасы внеклеточного матрикса (ECM) могут быть иммуноокрашены и визуализированы для отображения местоположения и топологии их компонентов.
Abstract
Мы представляем здесь протокол децеллюляризации сердца и легких мыши. Он создает структурные каркасы ECM, которые можно использовать для анализа топологии и состава ECM. Он основан на микрохирургической процедуре, предназначенной для катетеризации трахеи и аорты усыпленной мыши для перфузии сердца и легких децеллюляризирующими агентами. Децеллюляризованный сердечно-легочный комплекс впоследствии может быть иммуноокрашен, чтобы выявить расположение структурных белков ECM. Вся процедура может быть завершена за 4 дня.
Каркасы ECM, полученные в результате этого протокола, свободны от размерных искажений. Отсутствие ячеек позволяет проводить структурное исследование структур ECM вплоть до субмикронного разрешения в 3D. Этот протокол может быть применен к здоровым и больным тканям мышей в возрасте от 4 недель, включая мышиные модели фиброза и рака, открывая путь к определению ремоделирования ECM, связанного с сердечно-легочным заболеванием.
Introduction
ECM представляет собой трехмерную сеть, состоящую из белков и гликанов, которая вмещает все клетки в многоклеточном организме, придавая органам их форму и регулируя поведение клеток на протяжении всей жизни1. Начиная с оплодотворения яйцеклеток, клетки строят и реконструируют ECM и, в свою очередь, строго контролируются им. Целью этого протокола является открытие способа анализа и картирования ECM мыши, поскольку мыши являются наиболее используемым модельным организмом в патофизиологии млекопитающих.
Развитие этого метода было обусловлено необходимостью охарактеризовать и изолировать связанный с метастазами нативный ECM2. Поскольку опухоли не имеют надлежащей анатомической васкуляризации, а мыши являются относительно небольшими организмами, микрохирургические процедуры были разработаны для ретроградной катетеризации аорты, при этом изолируя кровообращение основного сосуда, ведущего к опухоли (например, легочных вен), тем самым фокусируя поток реагентов и позволяя децеллюляризацию опухоли. Этот метод создает каркасы ECM с сохраненной структурой2, которые могут быть иммуноокрашены и визуализированы, что позволяет отображать структуру ECM в субмикронных деталях. Для выполнения этого протокола необходимо приобрести хирургические и микрохирургические навыки (рассечение, микрозащищение и катетеризация), которые могут представлять собой потенциальное ограничение его использования. Насколько нам известно, этот метод представляет собой современное состояние для анализа нативной структуры ECM2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы децеллюляризации, основанные на тканевом перемешивании, изменяют структуру ECM, что делает их непригодными для анализа структуры ECM4. Перфузионная децеллюляризация с использованием анатомического пути, такого как аорта трахеи, позволяет достичь капиллярного русла и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим профессора Ивану Новак и доктора Нинн Майн Кристенсен (Центр усовершенствованной биовизуализации (CAB), Копенгагенский университет) за предоставление доступа к микроскопу. Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR и JTE); стипендия PhD от Фонда Лундбека (R286-2018-621; МР); Шведский исследовательский совет (2017-03389; МЧР); Шведское онкологическое общество, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, и 190007; МЧР); Немецкая онкологическая помощь (Deutsche Krebshilfe; РР); и Датское онкологическое общество (R204-A12454; РР).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
