뮤린 심폐 복합체의 탈세포화
Summary
이 프로토콜은 마우스의 심장과 폐를 탈세포화하는 것을 목표로합니다. 생성된 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드는 면역염색및 이미지화되어 구성요소의 위치와 토폴로지를 매핑할 수 있다.
Abstract
우리는 여기에 마우스 심장과 폐에 대한 탈세포화 프로토콜을 제시합니다. ECM 토폴로지 및 컴포지션을 분석하는 데 사용할 수 있는 구조적 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 그것은 탈세포 에이전트로 심혼 과 폐를 퍼퓨퓨어하기 위하여 안락사 마우스의 기관 및 대오르타를 카테터로 케이터터로 디자인된 미세 외과 절차를 기반으로 합니다. 탈세포화된 심폐 복합체는 구조적인 ECM 단백질의 위치를 밝히기 위하여 그 후에 면역염색될 수 있습니다. 전체 절차는 4 일 이내에 완료 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 발생하는 ECM 스캐폴드는 치수 왜곡이 없습니다. 세포의 부재는 3D에서 서브 미칸 해상도에 ECM 구조의 구조적 검사를 가능하게한다. 이 프로토콜은 섬유증과 암의 마우스 모델을 포함하여 4 주 된 어린 쥐로부터 건강하고 병에 걸린 조직에 적용 될 수 있으며, 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 결정하는 방법을 열어.
Introduction
ECM은 다세포 유기체의 모든 세포를 수용하는 단백질과 글리칸으로 만든 3차원 네트워크로, 장기에게 모양과 세포 거동을 평생 동안 조절합니다1. 계란 수정에서, 세포는 ECM을 구축하고 리모델링하고, 차례로 엄격하게 그것에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜의 목적은 마우스가 포유류 병리학학에서 가장 많이 사용되는 모델 유기체이기 때문에 마우스 ECM을 분석하고 매핑하는 방법을 여는 것이다.
이 방법의 개발은 전이 연관된 네이티브 ECM2의 특성화 및 분리의 필요성에 의해 주도되었다. 종양이 적당한 해부학 혈관화가 부족하고 마우스는 상대적으로 작은 유기체이기 때문에, 미세 외과 적 절차는 종양으로 이어지는 주요 혈관의 순환을 분리하면서 대동맥을 역행하도록 설계되었으며,이에 따라 시약 흐름에 초점을 맞추고 종양 탈세포화를 허용합니다. 이 방법은 면역 스테인드 및 이미지화 할 수있는 보존 된 구조2를 가진 ECM 스캐폴드를 생성하여 서브미칸 세부 사항으로 ECM 구조 매핑을 허용합니다. 이 프로토콜을 수행하기 위해, 그것의 사용에 잠재적인 한계를 나타낼 수 있는 외과 및 미세 수술 기술 (해부, 미세 주입 및 카테터화)를 취득할 필요가 있습니다. 우리의 지식에, 이 방법은 네이티브 ECM 구조 이미징 분석을 위한 최첨단을 나타냅니다2,3.
Protocol
Representative Results
Discussion
조직 동요에 기초한 탈세포화 기술은 ECM 구조를 변경하여 ECM 구조 분석에 적합하지 않습니다4. 관류 탈세포화는 기관의 대자와 같은 해부학 경로를 사용하여 모세관 침대 또는 말단 폐포에 도달 할 수 있으며 장기 전체에 세포 탈세포화제의 전달을 용이하게합니다. 조직 탈세포화를 위한 zwitterionic, 음이온 및 비이온 세제의 사용은 보고되지만<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 현미경 접근을 제공하기 위한 이바나 노박 교수와 Nynne Meyn Christensen 박사(코펜하겐 대학)에게 감사드립니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN)에 의해 지원되었다; AEM-G, OW, RR 및 JTE); 룬드벡 재단(R286-2018-621) 박사 과정 펠로우십; MR; 스웨덴 연구 위원회 (2017-03389; CDM); 스웨덴 암 학회, 암폰덴 (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, 및 190007; CDM); 독일 암 원조 (도이치 크렙실페; RR); 덴마크 암 학회 (R204-A12454; RR).
Materials
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 suture, triangular section needle (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 micro-suture (Safil) | B Braun | G1048611 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Adson forceps with teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Castroviejo microneedle holder | Fine Science Tools | no. 12061-01 | |
| CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia | |||
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm) | |||
| Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck) | Leica | S6 D | |
| Double-ended microspatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Dumont microforceps (two) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Dumont microforceps with 45° tips (two) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hair clippers | Oster | 76998-320-051 | |
| Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Intravenous 24-gauge catheter (Insyte) | BD | 381512 | |
| Intravenous 26-gauge catheter (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Mayo scissors (tough cut, straight) | Fine Science Tools | 14110-15 | |
| Microforceps with ringed tips (two) | Aesculap | FM571R | |
| Micro-spring scissors (Vannas, curved) | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Minicutter | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Molt Periostotome | Aesculap | D0543R | |
| Needles (27 gauge; Microlance) | BD | 21018 | |
| Paper towel (sterile) or surgical napkin | |||
| Serrated scissors (CeramaCut, straight) | Fine Science Tools | 14958-09 | |
| Spatula (Freer-Yasargil) | Aesculap | OL166R | |
| Syringes (1 mL; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| Syringes (10 mL; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| Tendon scissors (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A11037 | |
| BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized) | Serva | 11930.03 | |
| Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Host: rabbit |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Host: goat |
| Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621) | Host: guinea pig | ||
| Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Serum (normal donkey serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| IMAGING | |||
| Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; ) | Leica | ||
| Fluorescence light source | Leica | EL6000 | |
| Microscope (inverted multiphoton microscope) | Leica | SP5-X MP | |
| Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model) | |||
| White-light laser (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water | Plum | 1680766 | |
| Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7.4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peristaltic pump (with 12 channels) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.) | Ole Dich | 31399 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Sodium deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H&E STAINING | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% Ethanol | Plum | 201446-5L | |
| Absolute ethanol | Plum | 201152-1L | |
| Coverslips (24x50mm; 1000 pcs) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX mounting medium | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y solution alcoholic 0.5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs) | Pfm medical | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs) |
Thermofisher | 6319483 | |
| Mayers hematoxylin | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Slide scanner (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
References
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- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
