هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9
Summary
هنا نقدم مفصلة، بروتوكول خطوة بخطوة لهندسة الجينوم CRISPR/Cas9 القائم على الخلايا B البشرية الأولية لضربة قاضية الجينات (KO) وضرب في (KI) لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات في الخلايا B وتطوير العلاجات B-الخلية.
Abstract
الخلايا البائية هي خلايا لمفاوية مشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم وهي مكون رئيسي في الذراع الفكاهي للجهاز المناعي التكيفي. أنها تجعل المرشحين جذابة للعلاجات القائمة على الخلايا بسبب سهولة عزلها عن الدم المحيطي، وقدرتها على التوسع في المختبر، وطول عمرها في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام وظيفتها البيولوجية الطبيعية – لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة – للتعبير عن كميات كبيرة جدا من البروتين العلاجي ، مثل جسم مضاد مؤتلف لمكافحة العدوى ، أو إنزيم لعلاج أمراض الأنزيموباث. هنا، نقدم أساليب مفصلة لعزل الخلايا B البشرية الأولية من خلايا الدم الأحادية الطرفية (PBMCs) وتفعيل / توسيع الخلايا B المعزولة في المختبر. ثم نقوم بإظهار الخطوات التي ينطوي عليها استخدام نظام CRISPR/Cas9 ل KO الخاص بالموقع للجينات الذاتية في الخلايا B. هذه الطريقة تسمح لكو كفاءة الجينات المختلفة، والتي يمكن استخدامها لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات ذات الأهمية. ثم نقوم بإظهار خطوات استخدام نظام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل فيروسي (rAAV) مرتبط بال أدينو للتكامل الفعال لكل موقع من كاسيت التعبير المتحول في الخلايا B. يوفر هذا البروتوكول معا منصة هندسية خطوة بخطوة يمكن استخدامها في الخلايا B البشرية الأولية لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات وكذلك لتطوير علاجات الخلايا B.
Introduction
الخلايا B هي مجموعة فرعية من سلالة الخلايا الليمفاوية المستمدة من الخلايا الجذعية الدموية. أنها تؤدي دورا حاسما في الجهاز المناعي الفكاهي التكيفية من خلال إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة استجابة للتحديات المناعية1. الخلايا B هي أيضا سلائف خلايا الذاكرة B وخلايا البلازما المتمايزة بشكل نهائي وطويلة العمر ، وبالتالي توفير مناعة فكاهة دائمة2. خلايا البلازما، على وجه الخصوص، هي فريدة من نوعها بين الخلايا المناعية في قدرتها على إنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة محددة أثناء البقاء على قيد الحياة لسنوات أو عقود3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن سهولة العزلة عن الدم المحيطي تجعل نسب الخلية B مرشحا ممتازا للعلاجات الجديدة القائمة على الخلايا4.
في السابق ، تم استخدام طرق التكامل العشوائي ، مثل تلك التي تستخدم ناقلات العدسية أو جهاز الإرسال والاستقبال الجمال النائم ، لهندسة الخلايا B لتسليم المتحولين والتعبير5و6و7و8. ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير المحددة لهذه النهج تجعل من الصعب دراسة الوظائف البيولوجية لجين معين في الخلايا B وتحمل خطرا متأصلا من تكوين الغرز والتعبير المتحول المتغير و / أو إسكات في الإعداد العلاجي.
نظام CRISPR/Cas9 هو أداة قوية لهندسة الجينوم تسمح للباحثين بتحرير جينوم الخلايا المختلفة بدقة في العديد من الأنواع. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مجموعتين، بما في ذلك منطقتنا، بنجاح أساليب لتوسيع الجسم الحي السابق وهندسة الجينوم المستهدفة من الخلايا B البشريةالأولية 9،10. سوف نصف عملية تنقية الخلايا B البشرية الأولية من عينة leukaphoresis. بعد ذلك، سنصف بروتوكولنا المحدث لتوسيع الخلية B وتنشيط الخلايا B المعزولة. سنقوم بعد ذلك بوصف عملية لضرب مجموعة من التمايز 19 (CD19) ، وهي مستقبلات خلية B محددة وسمة مميزة للخلايا B ، عن طريق الكهرومporation لإدخال CRISPR / Cas9 mRNA جنبا إلى جنب مع CD19 sgRNA في الخلايا B المنشطة.
يحصل على ترجمة Cas9 ميرنا ويربط إلى SgRNA CD19 لتشكيل مجمع CRISPR/Cas9-sgRNA ريبونوكليوبروتين (RNP). في وقت لاحق، SgRNA في المجمع يؤدي Cas9 لخلق كسر حبلا مزدوجة (DSB) في التسلسل المستهدف على exon 2 من الجين. ستقوم الخلايا بإصلاح DSB عن طريق “الانضمام إلى نهاية غير متجانسة” عن طريق إدخال أو حذف النيوكليوتيدات ، مما يؤدي إلى طفرة frameshift والتسبب في خروج الجين. سنقوم بعد ذلك بقياس فقدان CD19 عن طريق قياس التدفق الخلوي وتحليل تشكيل indel عن طريق تتبع indels عن طريق تحليل التحلل (TIDE).
سنقوم بعد ذلك بوصف عملية استخدام CRISPR/Cas9 جنبا إلى جنب مع ناقل AAV6 المؤتلف (rAAV6 ، وهو قالب مانح للإصلاح الموجه بالهومولوجيا (HDR)) للتوسط في إدخال موقع محدد للبروتين الفلوري الأخضر المعزز(EGFP) في جين موقع تكامل الفيروسات المرتبط بال أدينو 1 (AAVS1). الجين AAVS1 هو مكان نشط دون وظائف بيولوجية معروفة وموقع التكامل الفيروسي AAV على الجينوم البشري. ولذلك، فإنه يعتبر “ملاذا آمنا” لهندسة الجينوم. هنا، ونحن التقرير أن التوسع وتنشيط الخلايا B يسمح للتوسع تصل إلى 44 أضعاف في 7 أيام من الثقافة (الشكل 1). وأظهر الكهرومporation من الخلايا B انخفاضا طفيفا في صحة الخلايا العامة (الشكل 2A) في 24 ساعة بعد العدوى. أظهر تحليل مخطط مبعثر لعلامة CD19 (الشكل 2B) انخفاضا يصل إلى 83٪ في الخلايا المحررة (الشكل 2C).
كشف تحليل TIDE للكروماتوغرافيات(الشكل 3A)أن النسبة المئوية لل indels كانت مشابهة لنسبة فقدان البروتين عن طريق قياس التدفق الخلوي(الشكل 3B). أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي لتجربة KI أن الخلايا التي تلقت متجه AAV(الشكل 4)، جنبا إلى جنب مع RNP ، عبرت عن ما يصل إلى 64٪ من الخلايا الإيجابية EGFP(الشكل 5A)وعرضت في وقت لاحق التكامل الناجح عن طريق تفاعل سلسلة البوليميراز التقاطعي (PCR) (الشكل 5B). وأظهرت تعدادات الخلايا أن جميع العينات سرعان ما تم استردادها في غضون 3 أيام بعد الهندسة(الشكل 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم هندسة الجينوم دقيقة في الخلايا B البشرية الأولية تحديا حتى وقت قريب9،10. كنا قد نشرت سابقا بروتوكولات باستخدام CRISPR / Cas9 لهندسة الخلايا B البشريةالأولية 9. هنا ، نوضح البروتوكولات المحسنة لعزل الخلايا B ، والتوسع ، والهندسة للسماح بكفاءة KO من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق أبحاث سرطان الأطفال (CCRF) والمعاهد الوطنية للصحة R01 AI146009 إلى B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
