CRISPR/Cas9를 사용하여 1차 인간 B 세포의 게놈 공학
Summary
여기서 우리는 B 세포에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하고 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 유전자 녹아웃 (KO) 및 노크 인 (KI)에 대한 1 차 인간 B 세포의 CRISPR / Cas9 기반 게놈 공학을위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
B 세포는 조혈 줄기 세포에서 파생된 림프구이며 적응성 면역 계통의 유머 팔의 핵심 성분입니다. 그(것)들은 말초 혈액에서 고립의 그들의 용이성 때문에 세포 기지를 둔 치료를 위한 매력적인 후보자, 시험관에서 확장하는 그들의 기능 및 생체 내의 그들의 장수 때문에. 또한, 그들의 정상적인 생물학적 기능-많은 양의 항체를 생산 하는-감염 을 싸우는 재조합 항체 와 같은 치료 단백질의 매우 많은 금액을 표현 하기 위해 활용 될 수 있다, 또는 효소 의 치료를 위한 효소. 여기서, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 1 차인간 B 세포를 격리하고 시험관 내에서 고립된 B 세포를 활성화/확장하는 상세한 방법을 제공합니다. 그런 다음 B 세포에서 내인성 유전자의 사이트 별 KO를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하는 데 관련된 단계를 시연합니다. 이 방법은 관심있는 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 사용할 수있는 다양한 유전자의 효율적인 KO를 허용합니다. 그런 다음 CrispR/Cas9 시스템을 B 세포에서 트랜스진 발현 카세트의 효율적인 현장 별 통합을 위한 재조합, 아데노 관련, 바이러스(rAAV) 벡터와 함께 사용하는 단계를 시연합니다. 이 프로토콜은 유전자의 생물학적 기능뿐만 아니라 B 세포 치료제의 개발을 연구하기 위해 1 차 인간 B 세포에서 사용할 수 있는 단계별 엔지니어링 플랫폼을 제공합니다.
Introduction
B 세포는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 림프구 계보의 하위 그룹이다. 그(것)들은 면역 도전1에응하여 항체의 다량을 생성하여 적응성 유머 면역 계통에 있는 중요한 역할을 능력을 발휘합니다. B세포는 또한 기억 B 세포의 전구체이며 말단 분화되고 수명이 긴 혈장 세포로, 지속적인 유머 면역2를제공한다. 플라즈마 세포, 특히, 년 또는 수십 년 동안 생존하는 동안 특정 항체의 다량을 생산하는 능력에 면역 세포 중 고유3. 또한, 말초 혈액으로부터의 분리의 용이성은 B 세포 혈통을 새로운 세포 기반 치료에 대한 우수한 후보로 만든다4.
이전에는 렌티바이러스 벡터 또는 슬리핑 뷰티 트랜스포슨을 사용하는 것과 같은 임의의 통합 방법이 트랜스진 전달 및 발현5,6,7,8을위해 B 세포를 설계하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이들 접근법의 비특이적 특성은 B 세포에서 특정 유전자의 생물학적 기능을 연구하기가 어렵게 만들고 치료 환경에서 삽입 돌연변이 발생 및 가변 적인 유전자 발현 및/또는 침묵의 본질적인 위험을 수반한다.
CRISPR/Cas9 시스템은 연구원이 수많은 종의 다양한 세포의 게놈을 정확하게 편집할 수 있는 강력한 게놈 엔지니어링 도구입니다. 최근에는 우리 자신을 포함한 두 그룹이 1차 인간 B 세포의 전 생체 확장 및 표적 게놈 공학을 위한 방법을 성공적으로 개발하였다9,10. 우리는 백혈구 샘플에서 1 차적인 인간 B 세포를 정화하는 과정을 설명할 것입니다. 그 후, 우리는 B 세포 확장 및 격리 된 B 세포의 활성화를위한 업데이트 된 프로토콜을 설명 합니다. 그런 다음 CD19 sgRNA와 함께 CRISPR/Cas9 mRNA를 활성화된 B 세포로 도입하기 위해 전기화에 의한 특정 B 세포 수용체 및 B 세포의 특징인 분화 19(CD19)의 클러스터를 노크하는 과정을 설명할 것입니다.
Cas9 mRNA는 변환되고 CRISPR/Cas9-sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)를 형성하기 위해 CD19 sgRNA에 결합한다. 이어서, 복합체내의 sgRNA는 Cas9를 이끌고 유전자의 엑슨 2에 대한 표적 서열에서 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. 세포는 뉴클레오티드를 도입하거나 삭제하여 “비 동종 종결합”에 의해 DSB를 복구하여 프레임 시프트 돌연변이로 이어지고 유전자가 기절하게 합니다. 그런 다음 유동 세포측정에 의한 CD19의 손실을 측정하고 분해(TIDE) 분석을 통해 인델 형성을 추적하여 인델 형성을 분석합니다.
그런 다음 CRISPR/Cas9를 재조합 AAV6 벡터(rAAV6, 상동성 지향 수리(HDR)를 위한 기증자 템플릿)을 사용하여 아데노 관련 바이러스 통합 사이트 1(AAVS1) 유전자에서 향상된 녹색형광단백질(EGFP)의 사이트별 삽입을 중재하는 과정을 설명합니다. AAVS1 유전자는 알려진 생물학적 기능 없이 활성 궤적이고 인간 게놈에 AAV 바이러스 통합 부위; 따라서 게놈 공학을 위한 “안전한 항구”로 간주됩니다. 여기서, B 세포의 팽창 및 활성화는 배양7일에서 최대 44배의 확장을 허용했다는 것을보고합니다(그림 1). B 세포의 전기기화는 24시간 후 형질전환에서 전체 세포건강(도 2A)의경미한 감소를 보였다. CD19마커(도 2B)의분산 플롯 분석은 편집된 셀(도2C)에서최대 83% 감소하는 것으로 나타났다.
크로마토그래프(도3A)의조류 분석은 %인델이 혈류 세포측정(도3B)에의한 %의 단백질 손실과 유사하다는 것을 밝혔다. KI 실험의 유동 세포 분석분석은 RNP와 함께 AAV벡터(도 4)를받은 세포가 최대 64% EGFP 양성 세포(도5A)까지표현되고 나중에 접합 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)(도5B)에의해 성공적인 통합을 표시한 것으로 나타났다. 셀 카운트는 모든 샘플이 엔지니어링 후 3일 이내에 신속하게 회수된 것으로나타났습니다(그림 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
1차 인간 B 세포에 있는 정확한 게놈 공학은 최근9,10까지도전적이고 있습니다. 우리는 이전에 CRISPR / Cas9를 사용하여 기본 인간 B 세포9을설계하는 프로토콜을 발표했습니다. 여기서는 CD19의 효율적인 KO 또는 노크인 EGFP를 위해 B-셀 격리, 확장 및 엔지니어링을 위한 향상된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 어린이 암 연구 기금 (CCRF)과 NIH R01 AI146009에서 B.S.M에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
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