Genoomtechniek van primaire menselijke B-cellen met CRISPR/Cas9
Summary
Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor CRISPR/ Cas9-gebaseerde genoomengineering van primaire menselijke B-cellen voor gen knock-out (KO) en knock-in (KI) om biologische functies van genen in B-cellen en de ontwikkeling van B-celtherapieën te bestuderen.
Abstract
B-cellen zijn lymfocyten afgeleid van hematopoëtische stamcellen en zijn een belangrijk onderdeel van de humorale arm van het adaptieve immuunsysteem. Ze zijn aantrekkelijke kandidaten voor celgebaseerde therapieën vanwege hun gemak van isolatie van perifeer bloed, hun vermogen om in vitro uit te breiden en hun lange levensduur in vivo. Bovendien kan hun normale biologische functie – om grote hoeveelheden antilichamen te produceren – worden gebruikt om zeer grote hoeveelheden van een therapeutisch eiwit uit te drukken, zoals een recombinant antilichaam om infectie te bestrijden, of een enzym voor de behandeling van enzymopathieën. Hier bieden we gedetailleerde methoden voor het isoleren van primaire menselijke B-cellen van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) en het activeren / uitbreiden van geïsoleerde B-cellen in vitro. Vervolgens demonstreren we de stappen die nodig zijn bij het gebruik van het CRISPR/Cas9-systeem voor site-specifieke KO van endogene genen in B-cellen. Deze methode maakt efficiënte KO van verschillende genen mogelijk, die kunnen worden gebruikt om de biologische functies van genen van belang te bestuderen. Vervolgens demonstreren we de stappen voor het gebruik van het CRISPR/Cas9-systeem samen met een recombinant, adeno-geassocieerde, virale (rAAV) vector voor een efficiënte site-specifieke integratie van een transgene expressiecassette in B-cellen. Samen biedt dit protocol een stapsgewijs engineeringplatform dat kan worden gebruikt in primaire menselijke B-cellen om biologische functies van genen te bestuderen en voor de ontwikkeling van B-celtherapieën.
Introduction
B-cellen zijn een subgroep van de lymfocytlijn afgeleid van hematopoëtische stamcellen. Ze vervullen een cruciale rol in het adaptieve humorale immuunsysteem door grote hoeveelheden antilichamen te produceren als reactie op immuunuitdagingen1. B-cellen zijn ook voorlopers van geheugen B-cellen en de terminaal gedifferentieerde, langlevende plasmacellen, waardoor blijvende humorale immuniteit wordt geboden2. Met name plasmacellen zijn uniek onder immuuncellen in hun vermogen om grote hoeveelheden van een specifiek antilichaam te produceren terwijl ze jaren of decennia overleven3. Bovendien maakt het gemak van isolatie van perifeer bloed de B-cel afstamming een uitstekende kandidaat voor nieuwe celgebaseerde therapieën4.
Voorheen werden willekeurige integratiemethoden, zoals die met lentivirale vectoren of een Doornroosje transposon, gebruikt om B-cellen te engineeren voor transgene levering en expressie5,6,7,8. De niet-specifieke aard van deze benaderingen maakt het echter moeilijk om de biologische functies van een specifiek gen in de B-cellen te bestuderen en brengt een inherent risico met zich mee van insertie mutagenese en variabele transgene expressie en/of demping in de therapeutische setting.
Het CRISPR/Cas9-systeem is een krachtig genoomtechnologietool waarmee onderzoekers het genoom van verschillende cellen in tal van soorten nauwkeurig kunnen bewerken. Onlangs hebben twee groepen, waaronder de onze, met succes methoden ontwikkeld voor ex vivo-expansie en gerichte genoomengineering van primaire menselijke B-cellen9,10. We zullen het proces beschrijven van het zuiveren van primaire menselijke B-cellen uit een leukafoormonster. Daarna beschrijven we ons bijgewerkte protocol voor B-celexpansie en activering van geïsoleerde B-cellen. We zullen dan een proces beschrijven voor het uitschakelen van cluster van differentiatie 19 (CD19), een specifieke B-celreceptor en een kenmerk van B-cellen, door elektroporatie om CRISPR / Cas9 mRNA samen met CD19 sgRNA in geactiveerde B-cellen te introduceren.
Cas9 mRNA wordt vertaald en bindt aan de CD19 sgRNA om een CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteïne complex (RNP) te vormen. Vervolgens leidt sgRNA in het complex Cas9 tot het creëren van double-strand break (DSB) bij de doelsequentie op exon 2 van het gen. De cellen zullen de DSB herstellen door “niet-homologe eindvoeging” door nucleotiden in te voeren of te verwijderen, wat leidt tot frameshift-mutatie en ervoor zorgt dat het gen wordt uitgeschakeld. Vervolgens meten we het verlies van CD19 door flowcytometrie en analyseren we de vorming van indels door het volgen van indels door decompositie (TIDE) analyse.
Vervolgens beschrijven we het proces van het gebruik van CRISPR/Cas9 samen met een recombinante AAV6-vector (rAAV6, een donorsjabloon voor homologie-gerichte reparatie (HDR)) om sitespecifieke invoeging van verbeterd groen fluorescerend eiwit(EGFP) te bemiddelen bij het adeno-geassocieerde virusintegratiesite 1 (AAVS1) gen. Het AAVS1-gen is een actieve locus zonder bekende biologische functies en een AAV virale integratieplaats op het menselijk genoom; daarom wordt het beschouwd als een “veilige haven” voor genoomtechniek. Hier melden we dat uitbreiding en activering van B-cellen tot 44-voudige expansie in 7 dagen cultuur mogelijk maakte (figuur 1). Elektroporatie van B-cellen vertoonde een lichte vermindering van de algehele celgezondheid (figuur 2A) na transfectie van 24 uur. De spreidingsplotanalyse van de CD19-markering (figuur 2B) liet tot 83% vermindering van de bewerkte cellen zien (figuur 2C).
Tide-analyse van de chromatografen (figuur 3A) toonde aan dat de % indels vergelijkbaar was met het % eiwitverlies door flowcytometrie (figuur 3B). Flowcytometrie-analyse van het KI-experiment toonde aan dat de cellen die een AAV-vector kregen (figuur 4), samen met RNP, tot 64% EGFP-positieve cellen (figuur 5A) uitdrukten en later een succesvolle integratie vertoonden door junction polymerasekettingreactie (PCR) (Figuur 5B). Celtellingen toonden aan dat alle monsters snel herstelden binnen 3 dagen na de engineering (Figuur 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurige genoomtechniek in primaire menselijke B-cellen was tot voor kort een uitdaging9,10. We hadden eerder protocollen gepubliceerd met CRISPR/Cas9 om primaire menselijke B-cellente engineeren 9. Hier schetsen we verbeterde protocollen voor B-cel isolatie, uitbreiding en engineering om efficiënte KO van CD19 of voor knock-in EGFP mogelijk te maken.
Hier laten we zien dat ons expansieprotocol de s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door het Children’s Cancer Research Fund (CCRF) en NIH R01 AI146009 aan B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
