Ingegneria genomica delle cellule B umane primarie utilizzando CRISPR/Cas9
Summary
Qui forniamo un protocollo dettagliato passo-passo per l’ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 delle cellule B umane primarie per knockout genico (KO) e knock-in (KI) per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle cellule B e lo sviluppo di terapie a cellule B.
Abstract
Le cellule B sono linfociti derivati da cellule staminali ematopoietiche e sono una componente chiave del braccio umoristico del sistema immunitario adattivo. Fanno candidati attraenti per le terapie a base cellulare a causa della loro facilità di isolamento dal sangue periferico, della loro capacità di espandersi in vitro e della loro longevità in vivo. Inoltre, la loro normale funzione biologica – per produrre grandi quantità di anticorpi – può essere utilizzata per esprimere grandi quantità di una proteina terapeutica, come un anticorpo ricombinante per combattere l’infezione, o un enzima per il trattamento delle ezimopatie. Qui, forniamo metodi dettagliati per isolare le cellule B umane primarie dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBBC) e attivare / espandere cellule B isolate in vitro. Dimostriamo quindi i passaggi necessari per l’utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 per ko site-specific di geni endogeni nelle cellule B. Questo metodo consente un KO efficiente di vari geni, che può essere utilizzato per studiare le funzioni biologiche dei geni di interesse. Vengono quindi dimostrati i passaggi per l’utilizzo del sistema CRISPR/Cas9 insieme a un vettore ricombinante, adeno-associato, virale (rAAV) per un’efficiente integrazione site-specific di una cassetta di espressione transgena nelle celle B. Insieme, questo protocollo fornisce una piattaforma ingegneristica passo-passo che può essere utilizzata nelle cellule B umane primarie per studiare le funzioni biologiche dei geni e per lo sviluppo di terapie a cellule B.
Introduction
Le cellule B sono un sottogruppo del linfocita derivato dalle cellule staminali ematopoietiche. Svolgono un ruolo fondamentale nel sistema immunitario umoristico adattivo producendo grandi quantità di anticorpi in risposta alle sfide immunitarie1. Le cellule B sono anche precursori delle cellule B della memoria e delle cellule plasmatiche di lunga durata differenziate e terminali, fornendo così un’immunità umorale duratura2. Le cellule plasmatiche, in particolare, sono uniche tra le cellule immunitarie nella loro capacità di produrre grandi quantità di un anticorpo specifico mentre sopravvivono per anni odecenni 3. Inoltre, la facilità di isolamento dal sangue periferico rende il lignaggio delle cellule B un ottimo candidato per nuove terapie a base cellulare4.
In precedenza, metodi di integrazione casuali, come quelli che utilizzano vettori lentivirali o un transposone della Bella Addormentata, sono stati utilizzati per progettare cellule B per la consegna transgena el’espressione 5,6,7,8. Tuttavia, la natura non specifica di questi approcci rende difficile studiare le funzioni biologiche di un gene specifico nelle cellule B e comporta un rischio intrinseco di mutagenesi inserimento ed espressione transgena variabile e/o silenziamento nell’ambiente terapeutico.
Il sistema CRISPR/Cas9 è un potente strumento di ingegneria genomica che consente ai ricercatori di modificare con precisione il genoma di varie cellule in numerose specie. Recentemente, due gruppi, tra cui il nostro, hanno sviluppato con successo metodi per l’espansione ex vivo e l’ingegneria genomica mirata delle cellule Bumane primarie 9,10. Descriveremo il processo di purificazione delle cellule B umane primarie da un campione di leucforesi. Successivamente, descriveremo il nostro protocollo aggiornato per l’espansione delle celle B e l’attivazione di celle B isolate. Descriveremo quindi un processo per eliminare il cluster di differenziazione 19 (CD19), uno specifico recettore delle cellule B e un segno distintivo delle cellule B, per elettroporazione per introdurre l’mRNA CRISPR /Cas9 insieme allo sgRNA CD19 nelle cellule B attivate.
Cas9 mRNA viene tradotto e si lega allo sgRNA CD19 per formare un complesso crispr/cas9-sgRNA ribonucleoproteina (RNP). Successivamente, lo sgRNA nel complesso porta Cas9 a creare una rottura a doppio filamento (DSB) alla sequenza bersaglio sull’esone 2 del gene. Le cellule ripareranno il DSB “unendo fine non omologha” introducendo o eliminando i nucleotidi, portando a mutazioni frameshift e causando l’eliminazione del gene. Misureremo quindi la perdita di CD19 per citometria del flusso e analizzeremo la formazione di indelenze tracciando le indeli mediante analisi di decomposizione (TIDE).
Descriveremo quindi il processo di utilizzo di CRISPR/Cas9 insieme a un vettore AAV6 ricombinante (rAAV6, un modello donatore per la riparazione diretta dall’omologia (HDR)) per mediare l’inserimento specifico del sito di proteine fluorescenti verdi avanzate(EGFP) nel gene 1 (AAVS1) adeno-associato al virus. Il gene AAVS1 è un locus attivo senza funzioni biologiche note e un sito di integrazione virale AAV sul genoma umano; pertanto, è considerato un “porto sicuro” per l’ingegneria del genoma. Qui, segnalamo che l’espansione e l’attivazione delle cellule B hanno permesso un’espansione fino a 44 volte in 7 giorni di coltura (Figura 1). L’elettroporazione delle cellule B ha mostrato una leggera riduzione della salute generale delle cellule(figura 2A)a 24 ore dopo la trasfezione. L’analisi del grafico a dispersione del marcatore CD19 (Figura 2B) ha mostrato una riduzione fino all’83% delle celle modificate (Figura 2C).
L’analisi TIDE dei cromatografi(figura 3A)ha rivelato che la % delle indeli era simile alla perdita di proteine % per citometria del flusso(figura 3B). L’analisi della citometria del flusso dell’esperimento KI ha mostrato che le cellule che hanno ricevuto vettore AAV (Figura 4), insieme all’RNP, hanno espresso fino al 64% di cellule positive all’EGFP (Figura 5A) e in seguito hanno mostrato un’integrazione riuscita mediante reazione a catena della polimerasi di giunzione (PCR)(Figura 5B). Il conteggio delle celle ha mostrato che tutti i campioni sono stati rapidamente recuperati entro 3 giorni dopo l’ingegneria (Figura 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ingegneria del genoma precisa nelle cellule B umane primarie è stata impegnativa fino apoco tempo fa 9,10. In precedenza avevamo pubblicato protocolli che utilizzavano CRISPR/Cas9 per progettare cellule B umane primarie9. Qui, delineamo protocolli migliorati per l’isolamento, l’espansione e l’ingegneria delle celle B per consentire un KO efficiente del CD19 o per l’eGFPknocking-in .
Qui dimostriamo c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Children’s Cancer Research Fund (CCRF) e dal NIH R01 AI146009 al B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
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