Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9
Summary
Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.
Abstract
As células B são linfócitos derivados de células-tronco hematopoiéticas e são um componente-chave do braço humorístico do sistema imunológico adaptativo. Eles fazem candidatos atraentes para terapias baseadas em células devido à sua facilidade de isolamento do sangue periférico, sua capacidade de expandir in vitro e sua longevidade in vivo. Além disso, sua função biológica normal — para produzir grandes quantidades de anticorpos — pode ser utilizada para expressar quantidades muito grandes de uma proteína terapêutica, como um anticorpo recombinante para combater a infecção, ou uma enzima para o tratamento de enzimas. Aqui, fornecemos métodos detalhados para isolar células B humanas primárias de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) e ativar/expandir células B isoladas in vitro. Em seguida, demonstramos as etapas envolvidas no uso do sistema CRISPR/Cas9 para ko específico do local de genes endógenos em células B. Este método permite um KO eficiente de vários genes, que podem ser usados para estudar as funções biológicas dos genes de interesse. Em seguida, demonstramos os passos para o uso do sistema CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor recombinante, associado a adeno, viral (rAAV) para uma integração eficiente específica do local de um de expressão transgênica em células B. Em conjunto, este protocolo fornece uma plataforma de engenharia passo a passo que pode ser usada em células B humanas primárias para estudar funções biológicas de genes, bem como para o desenvolvimento de terapêuticas de células B.
Introduction
As células B são um subgrupo da linhagem linfócito derivada de células-tronco hematopoiéticas. Eles desempenham um papel crítico no sistema imunológico humorálógico adaptativo, produzindo grandes quantidades de anticorpos em resposta aos desafios imunológicos1. As células B também são precursoras das células B da memória e das células plasmáticas de longa duração, com uma imunidade humoral duradoura2. As células plasmáticas, em particular, são únicas entre as células imunes em sua capacidade de produzir grandes quantidades de um anticorpo específico enquanto sobrevivem por anos ou décadas3. Além disso, a facilidade de isolamento do sangue periférico faz da linhagem de células B um excelente candidato para novas terapias baseadas em células4.
Anteriormente, métodos de integração aleatória, como aqueles que utilizam vetores lentivirais ou um transposon da Bela Adormecida, têm sido utilizados para projetar células B para entrega e expressão transgênicas5,6,7,8. No entanto, a natureza não específica dessas abordagens dificulta o estudo das funções biológicas de um gene específico nas células B e traz um risco inerente de mutagênese insercional e expressão transgênica variável e/ou silenciamento no cenário terapêutico.
O sistema CRISPR/Cas9 é uma poderosa ferramenta de engenharia de genomas que permite aos pesquisadores editar precisamente o genoma de várias células em inúmeras espécies. Recentemente, dois grupos, incluindo o nosso, desenvolveram com sucesso métodos de expansão ex vivo e engenharia de genomas direcionados das células B humanas primárias9,10. Descreveremos o processo de purificação das células B humanas primárias de uma amostra de leucemia. Depois disso, descreveremos nosso protocolo atualizado para expansão de células B e ativação de células B isoladas. Descreveremos então um processo para eliminar o cluster de diferenciação 19 (CD19), um receptor específico de células B e uma marca registrada das células B, por eletroporação para introduzir o CRISPR/Cas9 mRNA juntamente com o CD19 sgRNA em células B ativadas.
Cas9 mRNA é traduzido e se liga ao sgRNA CD19 para formar um complexo de ribonucleoproteína CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Posteriormente, o sgRNA no complexo leva Cas9 a criar quebra de dois fios (DSB) na sequência de destino no exon 2 do gene. As células repararão o DSB por “junção final não homólogoa” introduzindo ou excluindo nucleotídeos, levando à mutação de mudança de quadro e fazendo com que o gene seja eliminado. Em seguida, mediremos a perda de CD19 por citometria de fluxo e analisaremos a formação indeléxica através do rastreamento de indelés por análise de decomposição (MARÉ).
Descreveremos então o processo de utilização do CRISPR/Cas9 juntamente com um vetor AAV6 recombinante (rAAV6, um modelo de doador para reparo direcionado à homologia (HDR)) para mediar a inserção específica do local da proteína fluorescente verde aprimorada(EGFP) no gene de integração do local de integração do vírus associado a Adeno 1 (AAVS1). O gene AAVS1 é um lócus ativo sem funções biológicas conhecidas e um local de integração viral AAV no genoma humano; portanto, é considerado um “porto seguro” para a engenharia do genoma. Aqui, relatamos que a expansão e ativação de células B permitiu uma expansão de até 44 vezes em 7 dias de cultura(Figura 1). A eletroporação das células B apresentou ligeira redução da saúde celular global (Figura 2A) em 24 h após a transfecção. A análise da parcela de dispersão do marcador CD19 (Figura 2B) mostrou uma redução de até 83% nas células editadas(Figura 2C).
A análise da MARÉ dos cromatógrafos (Figura 3A) revelou que o % indels foi semelhante à % perda de proteína por citometria de fluxo(Figura 3B). A análise da citometria de fluxo do experimento KI mostrou que as células que receberam vetor AAV (Figura 4),juntamente com RNP, expressaram até 64% células positivas de EGFP(Figura 5A)e posteriormente apresentaram integração bem sucedida por reação de cadeia de polimerase de junção (PCR) (Figura 5B). A contagem de células mostrou que todas as amostras se recuperaram rapidamente em 3 dias após a engenharia (Figura 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
A engenharia precisa do genoma em células B humanas primárias tem sido desafiadora até recentemente9,10. Já havia publicado protocolos usando o CRISPR/Cas9 para projetar células B humanas primárias9. Aqui, delineamos protocolos aprimorados para isolamento, expansão e engenharia de células B para permitir ko eficiente de CD19 ou para bater-in EGFP.
Aqui demonstramos que nosso protocolo de expans?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa do Câncer Infantil (CCRF) e pelo NIH R01 AI146009 para a B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
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