Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9
Summary
Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape pour crispr / Cas9 basée sur l’ingénierie du génome des cellules B humaines primaires pour les gènes KNOCKOUT (KO) et knock-in (KI) pour étudier les fonctions biologiques des gènes dans les cellules B et le développement de la thérapeutique à cellules B.
Abstract
Les cellules B sont des lymphocytes dérivés de cellules souches hématopoïétiques et sont un composant clé du bras humoristique du système immunitaire adaptatif. Ils font des candidats attrayants pour les thérapies cellulaires en raison de leur facilité d’isolement du sang périphérique, leur capacité à se développer in vitro, et leur longévité in vivo. En outre, leur fonction biologique normale , pour produire de grandes quantités d’anticorps – peut être utilisé pour exprimer de très grandes quantités d’une protéine thérapeutique, comme un anticorps recombinant pour lutter contre l’infection, ou une enzyme pour le traitement des enzymopathies. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour isoler les cellules B humaines primaires des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs) et activer/étendre les cellules B isolées in vitro. Nous démontrons ensuite les étapes impliquées dans l’utilisation du système CRISPR/Cas9 pour le KO spécifique au site des gènes endogènes dans les cellules B. Cette méthode permet de KO efficace de divers gènes, qui peuvent être utilisés pour étudier les fonctions biologiques des gènes d’intérêt. Nous démontrons ensuite les étapes à prendre pour utiliser le système CRISPR/Cas9 ainsi qu’un vecteur viral recombinant, associé à l’adéno-associé (rAAV) pour une intégration efficace spécifique au site d’une cassette d’expression transgénique dans les cellules B. Ensemble, ce protocole fournit une plate-forme d’ingénierie étape par étape qui peut être utilisée dans les cellules B humaines primaires pour étudier les fonctions biologiques des gènes ainsi que pour le développement de la thérapeutique à cellules B.
Introduction
Les cellules B sont un sous-groupe de la lignée des lymphocytes dérivés des cellules souches hématopoïétiques. Ils jouent un rôle critique dans le système immunitaire adaptatif de l’humour en produisant de grandes quantités d’anticorps en réponse aux défis immunitaires1. Les cellules B sont également des précurseurs des cellules B de mémoire et des cellules plasmatiques en phase terminale différenciées et de longue durée, fournissant ainsi une immunité humoristiquedurable 2. Les cellules plasmatiques, en particulier, sont uniques parmi les cellules immunitaires dans leur capacité à produire de grandes quantités d’un anticorps spécifique tout en survivant pendant des années ou desdécennies 3. En outre, la facilité d’isolement du sang périphérique fait de la lignée des cellules B un excellent candidat pour les nouvelles thérapies cellulaires4.
Auparavant, des méthodes d’intégration aléatoires, telles que celles utilisant des vecteurs lentiviraux ou un transposon de la Belle au bois dormant, ont été utilisées pour concevoir des cellules B pour la livraison et l’expression transgéniques5,6,7,8. Cependant, la nature non spécifique de ces approches rend difficile l’étude des fonctions biologiques d’un gène spécifique dans les cellules B et comporte un risque inhérent de mutagenèse insertionnelle et d’expression transgénique variable et/ou de silencing dans le cadre thérapeutique.
Le système CRISPR/Cas9 est un puissant outil d’ingénierie du génome qui permet aux chercheurs de modifier avec précision le génome de diverses cellules chez de nombreuses espèces. Récemment, deux groupes, dont le nôtre, ont développé avec succès des méthodes d’expansion ex vivo et d’ingénierie génomique ciblée des cellules Bhumaines primaires 9,10. Nous décrira le processus de purification des cellules B humaines primaires à partir d’un échantillon de leucémie. Après cela, nous allons décrire notre protocole mis à jour pour l’expansion des cellules B et l’activation des cellules B isolées. Nous décrira ensuite un processus d’assommage du cluster de différenciation 19 (CD19), un récepteur spécifique des cellules B et une caractéristique des cellules B, par électroporation pour introduire l’ARNm CRISPR/Cas9 ainsi que le SGRNA CD19 dans les cellules B activées.
L’ARNm Cas9 est traduit et se lie au CD19 sgRNA pour former un complexe ribonucléoprotéine CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Par la suite, sgRNA dans le complexe conduit Cas9 à créer une rupture à double brin (DSB) à la séquence cible sur l’exon 2 du gène. Les cellules répareront l’ORD en « joignant l’extrémité non homologue » en introduisant ou en supprimant les nucléotides, ce qui entraîne une mutation du changement de cadre et l’étruisation du gène. Nous mesureons ensuite la perte de CD19 par cytométrie de débit et analyserons la formation d’indélébiles en suivant les indélébiles par analyse de décomposition (TIDE).
Nous décririons ensuite le processus d’utilisation de CRISPR/Cas9 avec un vecteur recombinant AAV6 (rAAV6, un modèle de donneur pour la réparation dirigée par homologie (HDR)) pour médiation de l’insertion spécifique au site de protéines fluorescentes vertes améliorées(EGFP) au site d’intégration du virus associé à l’adéno-associé 1 (AAVS1) gène. Le gène AAVS1 est un locus actif sans fonctions biologiques connues et un site d’intégration virale AAV sur le génome humain; par conséquent, il est considéré comme une « sphère de sécurité » pour l’ingénierie génomique. Ici, nous rapportons que l’expansion et l’activation des cellules B ont permis jusqu’à 44 fois l’expansion en 7 jours de culture (figure 1). L’électroporation des cellules B a montré une légère réduction de la santé globale des cellules (figure 2A) à 24 h post-transfection. L’analyse de l’intrigue scatter du marqueur CD19 (Figure 2B) a montré jusqu’à 83% de réduction dans les cellules éditées (Figure 2C).
L’analyse TIDE des chromatographes (figure 3A) a révélé que les indels en % étaient semblables à la perte de % de protéines par cytométrie de débit (figure 3B). L’analyse de cytométrie de flux de l’expérience KI a montré que les cellules qui ont reçu le vecteur AAV (figure 4), ainsi que le RNP, ont exprimé jusqu’à 64 % de cellules egfp-positives (figure 5A) et plus tard ont montré l’intégration réussie par la réaction en chaîne de polymétrose de jonction (PCR) (figure 5B). Le dénombrement des cellules a montré que tous les échantillons se sont rapidement rétablis dans les 3 jours suivantl’ingénierie ( figure 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ingénierie précise du génome dans les cellules B humaines primaires a été difficilejusqu’à récemment 9,10. Nous avions précédemment publié des protocoles utilisant CRISPR/Cas9 pour concevoir les cellules B humaines primaires9. Ici, nous décrivons des protocoles améliorés pour l’isolement, l’expansion et l’ingénierie des cellules B pour permettre un KO efficace de CD19 ou pour frapper-in EGFP.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le Children’s Cancer Research Fund (CCRF) et les NIH R01 AI146009 à B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
