Ingeniería genómica de células B humanas primarias usando CRISPR/Cas9
Summary
Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para la ingeniería genómica basada en CRISPR/Cas9 de células B humanas primarias para el knockout genético (KO) y el knock-in (KI) para estudiar las funciones biológicas de los genes en las células B y el desarrollo de la terapia de células B.
Abstract
Las células B son linfocitos derivados de células madre hematopoyéticas y son un componente clave del brazo humorístico del sistema inmunitario adaptativo. Hacen candidatos atractivos para terapias basadas en células debido a su facilidad de aislamiento de la sangre periférica, su capacidad para expandirse in vitro, y su longevidad in vivo. Además, su función biológica normal — para producir grandes cantidades de anticuerpos — se puede utilizar para expresar cantidades muy grandes de una proteína terapéutica, como un anticuerpo recombinante para combatir la infección, o una enzima para el tratamiento de las enzimopatías. Aquí, proporcionamos métodos detallados para aislar las células B humanas primarias de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y activar/expandir células B aisladas in vitro. A continuación, demostramos los pasos implicados en el uso del sistema CRISPR/Cas9 para el KO específico del sitio de genes endógenos en células B. Este método permite el KO eficiente de varios genes, que se pueden utilizar para estudiar las funciones biológicas de los genes de interés. A continuación, demostramos los pasos para utilizar el sistema CRISPR/Cas9 junto con un vector viral (rAAV) recombinante, asociado a adeno, para una integración eficiente específica del sitio de un cassette de expresión de transgénero en celdas B. Juntos, este protocolo proporciona una plataforma de ingeniería paso a paso que se puede utilizar en células B humanas primarias para estudiar las funciones biológicas de los genes, así como para el desarrollo de la terapia de células B.
Introduction
Las células B son un subgrupo del linfanato derivado de células madre hematopoyéticas. Desempeñan un papel crítico en el sistema inmune humorístico adaptativo mediante la producción de grandes cantidades de anticuerpos en respuesta a los desafíos inmunes1. Las células B también son precursoras de las células B de la memoria y las células plasmáticas de larga duración diferenciadas terminalmente, proporcionando así inmunidad humorística duradera2. Las células plasmáticas, en particular, son únicas entre las células inmunes en su capacidad para producir grandes cantidades de un anticuerpo específico mientras sobreviven durante años o décadas3. Además, la facilidad de aislamiento de la sangre periférica hace que el linaje de células B sea un excelente candidato para nuevas terapias basadas en células4.
Anteriormente, los métodos de integración aleatoria, como los que utilizan vectores lentivirales o un transposon de la Bella Durmiente, se han utilizado para diseñar células B para la entrega de transgéneros y la expresión5,6,7,8. Sin embargo, la naturaleza no específica de estos enfoques dificulta el estudio de las funciones biológicas de un gen específico en las células B y conlleva un riesgo inherente de mutagénesis insertal y expresión y/o silenciamiento variable de transgénero en el entorno terapéutico.
El sistema CRISPR/Cas9 es una poderosa herramienta de ingeniería del genoma que permite a los investigadores editar con precisión el genoma de varias células en numerosas especies. Recientemente, dos grupos, incluido el nuestro, han desarrollado con éxito métodos para la expansión ex vivo y la ingeniería genómica dirigida de las células B humanas primarias9,10. Describiremos el proceso de purificación de las células B humanas primarias de una muestra de leucoforesis. Después de eso, describiremos nuestro protocolo actualizado para la expansión de células B y la activación de celdas B aisladas. A continuación, describiremos un proceso para noquear un cúmulo de diferenciación 19 (CD19), un receptor específico de células B y un sello distintivo de las células B, mediante la electroporación para introducir el ARNM CRISPR/Cas9 junto con el ARGN CD19 en las células B activadas.
Cas9 mRNA se traduce y se une al SgRNA CD19 para formar un complejo crispr/cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP). Posteriormente, el esgRNA en el complejo lleva a Cas9 a crear rotura de doble hebra (DSB) en la secuencia objetivo en el exón 2 del gen. Las células repararán el OSD mediante “unión final no homóloga” mediante la introducción o eliminación de nucleótidos, lo que conduce a la mutación del cambio de trama y hace que el gen sea noqueado. A continuación, mediremos la pérdida de CD19 por citometría de flujo y analizaremos la formación de indel mediante el seguimiento de los indels mediante el análisis de la descomposición (TIDE).
A continuación, describiremos el proceso de uso de CRISPR/Cas9 junto con un vector AAV6 recombinante (rAAV6, una plantilla de donante para la reparación dirigida por homología (HDR)) para mediar la inserción específica del sitio de proteína fluorescente verde mejorada(EGFP) en el gen del sitio de integración del virus asociado al adeno 1 (AAVS1). El gen AAVS1 es un locus activo sin funciones biológicas conocidas y un sitio de integración viral AAV en el genoma humano; por lo tanto, se considera un “puerto seguro” para la ingeniería del genoma. Aquí, informamos que la expansión y activación de las células B permitió hasta 44 veces la expansión en 7 días de cultivo (Figura 1). La electroporación de las células B mostró una ligera reducción de la salud celular general(Figura 2A)a las 24 h después de la transfección. El análisis de la gráfica de dispersión del marcador CD19 (Figura 2B) mostró una reducción de hasta el 83% en las celdas editadas (Figura 2C).
El análisis tide de los cromatógrafos (Figura 3A) reveló que el % de indels era similar al % de pérdida de proteína por citometría de flujo (Figura 3B). El análisis de citometría de flujo del experimento KI mostró que las células que recibieron el vector AAV(Figura 4),junto con RNP, expresaron hasta un 64% de células positivas por EGFP(Figura 5A)y más tarde mostraron una integración exitosa por reacción en cadena de la polimerasa de unión (PCR) (Figura 5B). Los recuentos de células mostraron que todas las muestras se recuperaron rápidamente dentro de los 3 días posteriores a la ingeniería(Figura 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
La ingeniería precisa del genoma en células B humanas primarias ha sido un reto hasta hace poco9,10. Anteriormente habíamos publicado protocolos utilizando CRISPR/Cas9 para diseñar células B humanas primarias9. Aquí, delineamos protocolos mejorados para el aislamiento, expansión e ingeniería de células B para permitir un KO eficiente de CD19 o para la EGFP.
Aquí demostramos que nuestro protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Children’s Cancer Research Fund (CCRF) y nih R01 AI146009 a B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
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