CRISPR/Cas9 का उपयोग कर प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के जीनोम इंजीनियरिंग
Summary
यहां हम बी कोशिकाओं में जीन के जैविक कार्यों और बी-सेल चिकित्सा के विकास का अध्ययन करने के लिए जीन नॉकआउट (KO) और नॉक-इन (KI) के लिए प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं के CRISPR/Cas9-आधारित जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत, कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।
Abstract
बी कोशिकाएं हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त लिम्फोसाइट्स हैं और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के विनोदी हाथ का एक प्रमुख घटक हैं। वे परिधीय रक्त से अलगाव की आसानी, विट्रो में विस्तार करने की उनकी क्षमता, और वीवो में उनकी दीर्घायु के कारण सेल आधारित चिकित्सा के लिए आकर्षक उम्मीदवार बनाते हैं । इसके अतिरिक्त, उनके सामान्य जैविक कार्य- बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए- बहुत बड़ी मात्रा में चिकित्सीय प्रोटीन व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि संक्रमण से लड़ने के लिए एक रीकॉम्बिनेंट एंटीबॉडी, या एंजाइमोपैथी के उपचार के लिए एक एंजाइम। यहां, हम प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं को परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग करने और विट्रो में अलग-थलग बी कोशिकाओं को सक्रिय/विस्तारित करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं । हम तो बी कोशिकाओं में अंतर्जात जीन के साइट विशिष्ट KO के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करने में शामिल कदम प्रदर्शित करता है । यह विधि विभिन्न जीनों के कुशल KO के लिए अनुमति देती है, जिसका उपयोग ब्याज के जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके बाद हम बी कोशिकाओं में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति कैसेट के कुशल साइट-विशिष्ट एकीकरण के लिए एक रिकॉम्बिनेंट, एडेनो-संबद्ध, वायरल (आरएवी) वेक्टर के साथ CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए कदम प्रदर्शित करते हैं । साथ में, यह प्रोटोकॉल एक कदम-दर-कदम इंजीनियरिंग मंच प्रदान करता है जिसका उपयोग प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं में जीन के जैविक कार्यों के साथ-साथ बी-सेल चिकित्सा के विकास के लिए किया जा सकता है।
Introduction
बी कोशिकाएं हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल से प्राप्त लिम्फोसाइट वंश का एक उपसमूह हैं। वे प्रतिरक्षा चुनौतियों के प्रत्युत्तर में बड़ी मात्रा में एंटीबॉडी का उत्पादन करके अनुकूली ह्यूमरल इम्यून सिस्टम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। बी कोशिकाएं स्मृति बी कोशिकाओं और मरणासन्न विभेदित, लंबे समय तक रहने वाली प्लाज्मा कोशिकाओं के अग्रदूत भी हैं, जिससे स्थायी ह्यूमरल प्रतिरक्षा2प्रदान की जाती है। प्लाज्मा कोशिकाओं, विशेष रूप से, उनके लिए एक विशिष्ट एंटीबॉडी की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की क्षमता में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच अद्वितीय हैं, जबकि साल या दशकों के लिए जीवित3। इसके अतिरिक्त, परिधीय रक्त से अलगाव की आसानी बी-सेल वंश को उपन्यास सेल-आधारित चिकित्सा4के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाती है।
पहले, यादृच्छिक एकीकरण विधियों, जैसे लेंटीविराल वैक्टर या स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन का उपयोग करने वाले, ट्रांसजीन डिलीवरी और अभिव्यक्ति5,6,7,8के लिए बी कोशिकाओं को इंजीनियर करने के लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों की गैर-विशिष्ट प्रकृति बी कोशिकाओं में एक विशिष्ट जीन के जैविक कार्यों का अध्ययन करना मुश्किल बनाती है और इसमें सम्मिलनीय म्यूटेनेसिस और वेरिएबल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति और/या चिकित्सीय सेटिंग में मुंह बंद होने का अंतर्निहित जोखिम होता है ।
CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली जीनोम इंजीनियरिंग उपकरण है जो शोधकर्ताओं को कई प्रजातियों में विभिन्न कोशिकाओं के जीनोम को ठीक से संपादित करने की अनुमति देता है । हाल ही में, हमारे अपने सहित दो समूहों ने प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं9,10के पूर्व वीवो विस्तार और लक्षित जीनोम इंजीनियरिंग के लिए सफलतापूर्वक तरीके विकसित किए हैं। हम एक ल्यूकाफोरसिस नमूने से प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं को शुद्ध करने की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे। उसके बाद, हम बी-सेल विस्तार और अलग बी कोशिकाओं की सक्रियता के लिए हमारे अद्यतन प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे। इसके बाद हम सक्रिय बी कोशिकाओं में CD19 sgRNA के साथ CRISPR/Cas9 mRNA को पेश करने के लिए इलेक्ट्रोपाउशन द्वारा भेदभाव 19 (सीडी 19), एक विशिष्ट बी-सेल रिसेप्टर और बी कोशिकाओं की एक बानगी के क्लस्टर को खटखटाने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करेंगे ।
Cas9 mRNA अनुवाद हो जाता है और CD19 sgRNA के लिए एक CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein परिसर (RNP) बनाने के लिए बांधता है । इसके बाद, परिसर में sgRNA Cas9 जीन के exon 2 पर लक्ष्य अनुक्रम पर डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) बनाने के लिए जाता है । कोशिकाएं न्यूक्लियोटिड्स को शुरू करने या हटाने के द्वारा डीएसबी की मरम्मत करेंगी, जिससे फ्रेमशिफ्ट उत्परिवर्तन हो जाएगा और जीन को खटखटाया जा सकेगा । हम तो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD19 के नुकसान को मापने और अपघटन (ज्वार) विश्लेषण द्वारा indels की ट्रैकिंग द्वारा indel गठन का विश्लेषण करेंगे ।
इसके बाद हम एडेनो से जुड़े वायरस इंटीग्रेशन साइट 1 (AAVS1) जीन में बढ़ी हुई ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन(ईजीएफपी) की साइट-विशिष्ट प्रविष्टि को मध्यस्थता करने के लिए एक रिकॉम्बिनेंट AAV6 वेक्टर (rAAV6, होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के लिए एक दाता टेम्पलेट के साथ CRISPR/Cas9 का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे । AAVS1 जीन ज्ञात जैविक कार्यों और मानव जीनोम पर एक एएवी वायरल एकीकरण साइट के बिना एक सक्रिय लोकस है; इसलिए, इसे जीनोम इंजीनियरिंग के लिए “सुरक्षित बंदरगाह” माना जाता है। यहां, हम रिपोर्ट करते हैं कि बी कोशिकाओं के विस्तार और सक्रियण ने संस्कृति के 7 दिनों(चित्रा 1)में 44 गुना विस्तार की अनुमति दी। बी कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपाउशन ने 24 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन पर समग्र कोशिका स्वास्थ्य(चित्रा 2 ए)की थोड़ी कमी दिखाई । सीडी 19 मार्कर(चित्रा 2B)के स्कैटर प्लॉट विश्लेषण ने संपादित कोशिकाओं(चित्रा 2 सी)में 83% की कमी दिखाई।
क्रोमेटोग्राफ(चित्रा 3 ए)के ज्वार विश्लेषण से पता चला है कि% इनडेल फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 3B)द्वारा% प्रोटीन हानि के समान थे। केवाई प्रयोग के फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि आरएनपी के साथ मिलकर एएवी वेक्टर(चित्रा 4)प्राप्त करने वाली कोशिकाओं ने 64% ईजीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं(चित्रा 5A)को व्यक्त किया और बाद में जंक्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)(चित्रा 5B)द्वारा सफल एकीकरण प्रदर्शित किया। सेल की गिनती से पता चला है कि सभी नमूनों को जल्दी से 3 दिनों के भीतर बरामद के बाद इंजीनियरिंग(चित्रा 5C)।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं में सटीक जीनोम इंजीनियरिंग हाल ही में9,10तक चुनौतीपूर्ण रही है । हमने पहले प्राथमिक मानव बी कोशिकाओं9को इंजीनियर करने के लिए CRISPR/Cas9 का उपयोग करके ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को बच्चों के कैंसर अनुसंधान कोष (CCRF) और NIH R01 AI146009 से बी एस.M के लिए वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
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