Genomteknikk av primære humane B-celler ved hjelp av CRISPR/Cas9
Summary
Her tilbyr vi en detaljert, trinnvis protokoll for CRISPR/Cas9-basert genomteknikk av primære humane B-celler for genutslag (KO) og knock-in (KI) for å studere biologiske funksjoner av gener i B-celler og utvikling av B-celleterapeutikk.
Abstract
B-celler er lymfocytter avledet fra hematopoietiske stamceller og er en nøkkelkomponent i humoralarmen til det adaptive immunsystemet. De gjør attraktive kandidater til cellebaserte terapier på grunn av deres enkle isolasjon fra perifert blod, deres evne til å utvide in vitro og deres levetid in vivo. I tillegg kan deres normale biologiske funksjon – for å produsere store mengder antistoffer – brukes til å uttrykke svært store mengder terapeutisk protein, for eksempel et rekombinant antistoff for å bekjempe infeksjon, eller et enzymopatier. Her gir vi detaljerte metoder for å isolere primære menneskelige B-celler fra perifere blodmonynukleære celler (PBMCer) og aktivere / utvide isolerte B-celler in vitro. Deretter demonstrerer vi trinnene som er involvert i bruk av CRISPR/Cas9-systemet for stedsspesifikk KO av endogene gener i B-celler. Denne metoden muliggjør effektiv KO av ulike gener, som kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til gener av interesse. Vi demonstrerer deretter trinnene for bruk av CRISPR/Cas9-systemet sammen med en rekombinant, adeno-assosiert, viral (rAAV) vektor for effektiv stedsspesifikk integrasjon av en transgene uttrykkskassett i B-celler. Sammen gir denne protokollen en trinnvis ingeniørplattform som kan brukes i primære menneskelige B-celler for å studere biologiske funksjoner av gener så vel som for utvikling av B-celleterapeutikk.
Introduction
B-celler er en undergruppe av lymfocyttlinjen avledet fra hematopoietiske stamceller. De utfører en kritisk rolle i det adaptive humorale immunforsvaret ved å produsere store mengder antistoffer som svar på immunutfordringer1. B-celler er også forløpere til minne B-celler og de terminalt differensierte, langlivede plasmacellene, og gir dermed varig humoristisk immunitet2. Spesielt plasmaceller er unike blant immunceller i deres evne til å produsere store mengder av et bestemt antistoff mens de overlever i år eller tiår3. I tillegg gjør enkel isolasjon fra perifert blod B-cellelinjen til en utmerket kandidat for nye cellebaserte terapier4.
Tidligere har tilfeldige integrasjonsmetoder, for eksempel de som bruker lentivirale vektorer eller en Sleeping Beauty-transposon, blitt brukt til å konstruere B-celler for transgene levering og uttrykk5,6, 7,8. Imidlertid gjør den ikke-spesifikke karakteren av disse tilnærmingene det vanskelig å studere de biologiske funksjonene til et bestemt gen i B-cellene og bærer en iboende risiko for innsetting av mutagenese og variabel transgene uttrykk og / eller silencing i terapeutisk setting.
CRISPR/Cas9-systemet er et kraftig genomteknikkverktøy som gjør det mulig for forskere å redigere genomet til ulike celler nøyaktig i mange arter. Nylig har to grupper, inkludert våre egne, vellykket utviklet metoder for ex vivo-utvidelse og målrettet genomteknikk av primære menneskelige B-celler9,10. Vi vil beskrive prosessen med å rense primære humane B-celler fra en leukaforeseprøve. Etter det vil vi beskrive vår oppdaterte protokoll for B-celleutvidelse og aktivering av isolerte B-celler. Vi vil deretter beskrive en prosess for å slå ut klyngen av differensiering 19 (CD19), en spesifikk B-cellereseptor og et kjennetegn på B-celler, ved elektroporasjon for å introdusere CRISPR / Cas9 mRNA sammen med CD19 sgRNA i aktiverte B-celler.
Cas9 mRNA blir oversatt og binder seg til CD19 sgRNA for å danne et CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteinkompleks (RNP). Deretter fører sgRNA i komplekset Cas9 til å skape dobbeltstrengsbrudd (DSB) ved målsekvensen på exon 2 av genet. Cellene vil reparere DSB ved “ikke-homolog slutt sammenføyning” ved å introdusere eller slette nukleotider, noe som fører til framehift mutasjon og forårsaker at genet blir slått ut. Vi vil deretter måle tapet av CD19 ved strømningscytometri og analysere indeldannelse ved sporing av indels ved dekomponering (TIDE) analyse.
Vi vil deretter beskrive prosessen med å bruke CRISPR/Cas9 sammen med en rekombinant AAV6-vektor (rAAV6, en donormal for homologistyrt reparasjon (HDR)) for å formidle stedsspesifikk innsetting av forbedret grønt fluorescerende protein(EGFP) på det adeno-tilknyttede virusintegrasjonsstedet 1 (AAVS1) genet. AAVS1-genet er et aktivt locus uten kjente biologiske funksjoner og et AAV viralt integrasjonssted på det menneskelige genom; Derfor regnes det som en “trygg havn” for genomteknikk. Her rapporterer vi at utvidelse og aktivering av B-celler tillot opptil 44 ganger ekspansjon på 7 dager med kultur (figur 1). Elektroporasjon av B-celler viste en liten reduksjon av den totale cellehelsen (figur 2A) ved 24 timers ettertransfeksjon. Scatter-plottanalysen av CD19-merket (figur 2B) viste opptil 83 % reduksjon i de redigerte cellene (figur 2C).
TIDE-analysen av kromatografiene (figur 3A) viste at % indels var lik % proteintap ved strømningscytometri (figur 3B). Flowcytometrianalyse av KI-eksperimentet viste at cellene som fikk AAV-vektor (figur 4), sammen med RNP, uttrykte opptil 64% EGFP-positive celler (figur 5A) og senere viste vellykket integrasjon ved knutepunktpolymerasekjedereaksjon (PCR) (Figur 5B). Celleantall viste at alle prøver raskt ble gjenopprettet innen 3 dager etter teknikk (Figur 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Presis genomteknikk i primære humane B-celler har vært utfordrende inntil nylig9,10. Vi hadde tidligere publisert protokoller ved hjelp av CRISPR/Cas9 for å konstruere primære menneskelige B-celler9. Her skisserer vi forbedrede protokoller for B-celleisolasjon, utvidelse og ingeniørarbeid for å muliggjøre effektiv KO av CD19 eller for knocking-in EGFP.
Her viser vi at vår ekspansjonsprotokoll ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Children’s Cancer Research Fund (CCRF) og NIH R01 AI146009 til B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
