Genomteknik för primära mänskliga B-celler med CRISPR/Cas9
Summary
Här tillhandahåller vi ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för CRISPR/Cas9-baserad genomteknik av primära mänskliga B-celler för gen knockout (KO) och knock-in (KI) för att studera biologiska funktioner hos gener i B-celler och utveckling av B-cellsterapier.
Abstract
B-celler är lymfocyter som härrör från hematopoetiska stamceller och är en viktig komponent i det adaptiva immunsystemets humorala arm. De gör attraktiva kandidater för cellbaserade terapier på grund av deras enkla isolering från perifert blod, deras förmåga att expandera in vitro och deras livslängd in vivo. Dessutom kan deras normala biologiska funktion – för att producera stora mängder antikroppar – användas för att uttrycka mycket stora mängder av ett terapeutiskt protein, såsom en rekombinant antikropp för att bekämpa infektion eller ett enzym för behandling av enzymopatier. Här tillhandahåller vi detaljerade metoder för att isolera primära mänskliga B-celler från perifert blod mononukleära celler (PBMCs) och aktivera/expandera isolerade B-celler in vitro. Vi demonstrerar sedan de steg som är involverade i att använda CRISPR/Cas9-systemet för platsspecifik KO av endogena gener i B-celler. Denna metod möjliggör effektiv KO av olika gener, som kan användas för att studera de biologiska funktionerna hos gener av intresse. Vi demonstrerar sedan stegen för att använda CRISPR/Cas9-systemet tillsammans med en rekombinant, adeno-associerad, viral (rAAV) vektor för effektiv platsspecifik integration av en transgene uttryckskassett i B-celler. Tillsammans ger detta protokoll en steg-för-steg-teknisk plattform som kan användas i primära mänskliga B-celler för att studera biologiska funktioner hos gener samt för utveckling av B-cellsterapier.
Introduction
B-celler är en undergrupp av lymfocyt härstamningen härrör från hematopoetiska stamceller. De utför en kritisk roll i det adaptiva humorala immunsystemet genom att producera stora mängder antikroppar som svar på immunutmaningar1. B-celler är också föregångare till minne B-celler och de terminalt differentierade, långlivade plasmacellerna, vilket ger varaktig humoral immunitet2. Plasmaceller är i synnerhet unika bland immunceller i deras förmåga att producera stora mängder av en specifik antikropp medan de överlever i år eller årtionden3. Dessutom gör den enkla isoleringen från perifert blod B-cells härstamningen till en utmärkt kandidat för nya cellbaserade terapier4.
Tidigare har slumpmässiga integrationsmetoder, såsom de som använder lentivirala vektorer eller en Törnrosatransposon, använts för att konstruera B-celler för transgeneleverans ochuttryck 5,6,7,8. Den icke-specifika karaktären hos dessa metoder gör det dock svårt att studera de biologiska funktionerna hos en specifik gen i B-cellerna och medför en inneboende risk för infogning av mutagenes och variabelt transgeneuttryck och/eller tystning i den terapeutiska miljön.
CRISPR/Cas9-systemet är ett kraftfullt genomteknikverktyg som gör det möjligt för forskare att exakt redigera arvsmassan hos olika celler i många arter. Nyligen har två grupper, inklusive vår egen, framgångsrikt utvecklat metoder för ex vivo expansion och riktad genomteknik av primära mänskliga B-celler9,10. Vi kommer att beskriva processen att rena primära mänskliga B-celler från ett leukaforesprov. Därefter kommer vi att beskriva vårt uppdaterade protokoll för B-cellsexpansion och aktivering av isolerade B-celler. Vi kommer sedan att beskriva en process för att slå ut kluster av differentiering 19 (CD19), en specifik B-cellsreceptor och ett kännetecken för B-celler, genom elektroporation för att introducera CRISPR / Cas9 mRNA tillsammans med CD19 sgRNA i aktiverade B-celler.
Cas9 mRNA översätts och binds till CD19 sgRNA för att bilda ett CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoproteinkomplex (RNP). Därefter leder sgRNA i komplexet Cas9 att skapa dubbelsträngsbrytning (DSB) vid målsekvensen på exon 2 av genen. Cellerna kommer att reparera DSB genom “icke-homolog end joining” genom att införa eller ta bort nukleotider, vilket leder till frameshift mutation och orsakar genen slås ut. Vi kommer sedan att mäta förlusten av CD19 genom flödescytometri och analysera indelbildning genom att spåra indels genom nedbrytning (TIDE) analys.
Vi kommer sedan att beskriva processen att använda CRISPR / Cas9 tillsammans med en rekombinant AAV6 vektor (rAAV6, en givarmall för homologi-riktad reparation (HDR)) för att medla platsspecifik insättning av förbättrat grönt fluorescerande protein (EGFP) vid den adeno-associerade virusintegrationsplats 1 (AAVS1) genen. AAVS1-genen är en aktiv locus utan kända biologiska funktioner och en AAV viral integrationsplats på det mänskliga genomet; Därför anses det vara en “säker hamn” för genomteknik. Här rapporterar vi att expansion och aktivering av B-celler tillät upp till 44-faldig expansion under 7 dagars kultur (figur 1). Elektroporering av B-celler visade en liten minskning av den totala cellhälsan (figur 2A) vid 24 h post-transfection. Spridningsdiagramanalysen av CD19-markören(figur 2B)visade en minskning av de redigerade cellerna med upp till 83 % (figur 2C).
TIDE:s analys av kromatograferna (figur 3A) visade att de % indels liknade den % proteinförlusten genom flödescytometri (figur 3B). Flödescytometrianalysen av KI-experimentet visade att cellerna som fick AAV-vektor (figur 4), tillsammans med RNP, uttryckte upp till 64% EGFP-positiva celler (figur 5A) och senare visade framgångsrik integration genom junction polymeraskedjereaktion (PCR) (Figur 5B). Antalet celler visade att alla prover snabbt återhämtade sig inom 3 dagar efter tekniken (figur 5C).
Protocol
Representative Results
Discussion
Exakt genomteknik i primära mänskliga B-celler har varit utmanande fram till nyligen9,10. Vi hade tidigare publicerat protokoll med CRISPR /Cas9 för att konstruera primära mänskliga B-celler9. Här beskriver vi förbättrade protokoll för isolering, expansion och teknik av B-celler för att möjliggöra effektiv KO för CD19 eller för inknackning av EGFP.
Här visar vi att vårt expansionsprotoko…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av Children’s Cancer Research Fund (CCRF) och NIH R01 AI146009 till B.S.M.
Materials
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy – Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
