Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

TGF-β medieret endotel til mesenchymal overgang (EndMT) og funktionel vurdering af EndMT-effektorer ved hjælp af CRISPR/Cas9-genredigering

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62198
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1,2
1Dept. Cell Chemical Biology, Leiden University Medical Center, 2Oncode Institute, Leiden University Medical Center

Summary

Vi beskriver metoder til at undersøge TGF-β2-induceret EndMT i endotelceller ved at observere cellemorfologiændringer og undersøge udtrykket EndMT-relaterede markørændringer ved hjælp af immunfluorescensfarvning. CRISPR/Cas9 genredigering blev beskrevet og brugt til at nedbryde genet kodning Snail at undersøge sin rolle i TGF-β2-induceret EndMT.

Abstract

Som svar på specifikke eksterne signaler og aktivering af visse transskriptionsfaktorer kan endotelceller differentiere sig til en mesenchymal-lignende fænotype, en proces, der kaldes endotel til mesenchymal overgang (EndMT). Nye resultater har antydet, at EndMT er kausalt forbundet med flere menneskelige sygdomme, såsom fibrose og kræft. Desuden kan endotel-afledte mesenchymale celler anvendes i vævsgendannelsesprocedurer, da de kan differentieres yderligere i forskellige celletyper (f.eks. osteoblaster og chondrocytter). Således kan den selektive manipulation af EndMT have klinisk potentiale. Ligesom epitel-mesenchymal overgang (EMT), endmt kan være stærkt induceret af den udskillede cytokin omdanne vækstfaktor-beta (TGF-β), som stimulerer udtryk for såkaldte EndMT transskription faktorer (EndMT-TFs), herunder Snail og Slug. Disse EndMT-TF'er derefter op-og nedregulere niveauerne af mesenchymale og endotelproteiner, henholdsvis. Her beskriver vi metoder til at undersøge TGF-β-induceret EndMT in vitro, herunder en protokol til at studere den rolle, som bestemte TF'er i TGF-β-induceret EndMT. Ved hjælp af disse teknikker fremlægger vi dokumentation for, at TGF-β2 stimulerer EndMT i murin pancreas mikrovaskulære endotelceller (MS-1 celler), og at den genetiske udtømning af Snegl ved hjælp af grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9)-medieret genredigering, ophæver dette fænomen. Denne tilgang kan tjene som model til at afhøre potentielle modulatorer af endotelbiologi og kan bruges til at udføre genetiske eller farmakologiske skærme med henblik på at identificere nye regulatorer af EndMT med potentiel anvendelse i menneskelig sygdom.

Introduction

Endotel til mesenchymal overgang (EndMT) er et multistep og dynamisk biologisk fænomen, der har været forbundet med forskellige fysiologiske og patologiske processer1,2. Ved EndMT mister endotelceller gradvist deres endotelegenskaber, mens de erhverver mesenchymale egenskaber3; således tæt komprimeret og velorganiseret endotelceller differentiere sig til aflange mesenchymal-lignende celler. Morfologiske ændringer i EndMT falder sammen med ændringer i udtrykket af visse gener og proteiner. Generelt falder ekspressionen af proteiner, der opretholder endotelegenskaber, herunder vaskulær endotel (VE)-cadherin, blodplade/EF-vedhæftningsmolekyle-1 (CD31/Pecam-1). Samtidig akkumuleres proteiner relateret til mesenchymale funktioner, såsom α-smooth muskel actin (α-Sma) og glat muskelprotein 22α (Sm22α). Nye resultater har vist, at postnatal EndMT bidrager til udviklingen af menneskelige sygdomme, såsom kræft, hjertefibrose, lungepulsåren hypertension (PAH), åreforkalkning (AS), organfibroseosv. 2,4,5,6,7. En dybere forståelse af de underliggende mekanismer i EndMT, og hvordan man styrer EndMT-processen, vil give nye terapeutiske metoder til EndMT-relaterede sygdomme og regenerativ medicin.

TGF-β er en af de vigtigste EndMT-inducere, og andre kendte involverede faktorer omfatter Wnt /β-catenin, Notch og nogle inflammatoriske cytokiner1. Da den cellulære kontekst er nøglen til svar udløst af TGF-β, er samspillet mellem TGF-β med andre EndMT-promoveringssignaler relevant for TGF-β at fremkalde et EndMT-svar. Ved aktivering af TGF-β celleoverfladetype I og type II serin/threonine kinase receptorer aktiveres den intracellulære kanoniske Smad-vej. TGF-β receptor-medieret fosforlateret Smad2/3 danner heteromeriske komplekser med Smad4, der omfordeler til kernen, hvor de opregulerer udtrykket af EndMT-relaterede transskriptionsfaktorer. I lighed med epitel-mesenchymal overgang (EMT), transskription faktorer som Snail, Slug, Twist, Zeb1 og Zeb2 er induceret af TGF-β signalering og bidrage til genprogrammering i EndMT8.

Snegl er ofte blevet identificeret som en nøglefaktor i EndMT. Snail binder sig til initiativtageren til gener, der kodper cellecelle vedhæftningsproteiner og undertrykker deres transskription, hvilket opvejes af forbedringen af udtrykket af mesenchymale proteiner9. Endotelceller omfatter en meget heterogen population, og den relative indflydelse af forskellige ekstracellulære stimuli på EndMT kan variere mellem endotelcellekontekster eller celletyper10. På grund af dets ligheder med EMT er nogle metoder nyttige til at undersøge begge mekanismer EMT og EndMT8. I denne forbindelse understreger EMT International Association (TEMTIA) kraftigt behovet for komplementære teknikker til i sidste ende at påvise forekomsten af EMT/EndMT11.

Her beskriver vi en metode til at overvåge og visualisere TGF-β-induceret EndMT-proces. Immunfluorescensfarvning giver de grundlæggende oplysninger om udtryksændringer i målrettede proteiner/markører, der bruges som indikatorer for, om EndMT-processen forekommer. Derudover kan immunfluorescens farvning visualisere lokalisering af proteiner / markører og cellemorfologi. For at studere den potentielle aktivitet af specifikke TF'er (eller andre opstrøms- eller downstream-regulatorer), der er involveret i TGF-β medieret EndMT, beskriver vi en protokol, der bruger grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) genredigering til at nedbryde specifikke gener fra celler ved hjælp af TF Snail som et eksempel. Cas9 er en dobbelt RNA-guidet DNA-endonuklease, der genkender og kløver sekvenser, der supplerer CRISPR-sekvenser i bakterie12. CRISPR/Cas9-systemet anvendes i øjeblikket i vid udstrækning, fordi det letter genteknologi in vitro og in vivo13. Instrueret af en enkelt guide RNA (sgRNA), ectopically udtrykt Cas9 genererer en dobbelt streng pause på en forudvalgt målretning sekvens i et bestemt gen locus. Ikke-homolog endeføjning (NHEJ) finder sted for at reparere Cas9-inducerede strengbrud via tilfældige nukleotidindføringer eller sletninger, hvilket fører til forstyrrelse og inaktivering af det målrettede gen. Vi beskriver detaljeret metoder til design af selektive sgRNA'er og generering af lentivirale kompatible vektorer, der indeholder de designede sgRNA'er. Som følge heraf kan stabile genforarmede endotelceller genereres på en effektiv og pålidelig måde.

I denne undersøgelse brugte vi murin pancreas mikrovaskulære endotelceller (MS-1)14 som et modelsystem til at undersøge TGF-β2-induceret EndMT-processen. Vores tidligere undersøgelse viste, at Snail er den vigtigste transskriptionsfaktor øget med TGF-β2, hvormed EndMT induceres i MS-1 celler15. Ved CRISPR/Cas9-genredigering for at ophæve Snail-ekspression i MS-1-celler kunne TGF-β2 ikke mægle i EndMT. Denne arbejdsgang kan anvendes til at studere andre (formodede) EndMT-relaterede gener.

Protocol

1. Indførelse af EndMT af TGF-β2

  1. MS-1-celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM), der indeholder 10% føtalt kvægserum (FBS) og 100 U/mL penicillin/streptomycin i en inkubator (5% CO2, 37 °C). Coat alle kultur retter / plader med 0,1% w / v gelatine i 10 minutter før brug.
  2. Vask forsigtigt MS-1-celler med 1x fosfat buffered saltvand (PBS), tilsæt 2 ml trypsin-EDTA-opløsning (0,25% trypsin og 0,02% EDTA) til en 10 cm skål, og inkuber i 2 minutter ved 37 °C for at løsne dem. Derefter tilsættes 5 mL komplet kulturmedium for at slukke reaktionen.
  3. Celleaffjedringen overføres til et 15 mL rør og centrifuge ved 200 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
  4. Supernatanten kasseres og genanvendes cellerne i 4 ml frisk medium indeholdende FBS og penicillin/streptomycin. Tæl cellerne ved hjælp af en automatisk celletæller.
  5. Frø 1 x 103 celler pr. cm2 for yderligere kultur. For eksempel frø 9,5 x 103 celler / godt for 6-brønd plader, eller 1,9 x 103 celler / godt for 24-brønd plader.
  6. Inkuber cellerne natten over for at give dem mulighed for at klæbe og komme sig, og stimulerer derefter MS-1-celler med TGF-β2 i 3 dage. TGF-β receptor kinase inhibitor SB431542 (5 μM) tilsættes 30 min før TGF-β2 stimulation. Behandl andre celler med køretøj (DMSO).
    BEMÆRK: TGF-β2 opløses i 4 mM HCl indeholdende 0,1% humant serumalbumin (BSA). Føj den samme mængde ligandbuffer uden TGF-β2 til kontrolgruppen. TGF-β2-koncentrationen kan tilpasses til 0,1-1 ng/mL for specifikke assays. Se angivelserne i de tilsvarende tal.
  7. Efter 3 dage skal du undersøge cellemorfologien med lys feltbilleddannelse (med et omvendt mikroskop) og udføre immunfluorescensfarvning (se trin 2) for at vurdere EndMT-relaterede markørændringer. Udfør mindst tre uafhængige eksperimenter for at opnå biologiske triplikater.

2. Immunfluorescens farvning

  1. Trypsiniser dyrkede MS-1 celler (trin 1.2) og derefter reseed 1,9 x 103 celler på en 0,1% w / v gelatine-belagt 12 mm rundt dækglas placeret på bunden af en 24-brønds plade.
  2. Efter dyrkning af cellerne natten over tilsættes TGF-β2 (endelig koncentration 1 ng/mL) til cellerne i 3 dage. Brug et medie, der indeholder ligandbufferen, som et negativt kontrolelement.
  3. Udfør Pecam-1 og Sm22α farvning.
    1. Efter at have stimuleret cellerne med TGF-β2 (eller Control) i 3 dage, skal du fjerne mediet og vaske cellerne med 1x PBS.
    2. Tilsæt 300 μL på 4% formaldehyd til hver brønd og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur for at rette cellerne. Vask 3x med 1x PBS efter inkubation.
    3. Tilsæt 300 μL på 0,1% Triton X-100 i 1x PBS til hver brønd og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur for at gennemtrænge cellerne. Efter inkubation fjernes Triton X-100-opløsningen og cellerne vaskes 3x med 1x PBS.
    4. Bloker cellerne med 3% kvæg serum albumin (BSA) i 1x PBS i 45 min ved stuetemperatur.
    5. Fortynd de primære Pecam-1- og Sm22α-antistoffer, der genkender murinproteiner 1:500 med 1x PBS. Derefter inkuberes de faste celler med primære antistoffer i 45 minutter ved stuetemperatur.
    6. Efter vask 3x med 1x PBS, inkuber cellerne med 1000x fortyndet sekundære antistoffer, herunder æsel anti-rotte Alexa 488 og ged anti-kanin Alexa 594, i 45 min ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Beskyt prøverne mod lys under farvning.
    7. Efter skylning 3x med 1x PBS, placere dækglasset seedet med celler med forsiden nedad på en dråbe montering medium, der indeholder 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) på et dias til at plette kernerne.
    8. Dækglassets periferi fastgørs med gennemsigtig neglelak, og den opbevares ved 4 °C.
    9. Anskaf repræsentative billeder med et konfokalt mikroskop. Sæt laserbølgelængderne til henholdsvis 405 nm, 488 nm og 552 nm for at registrere HENHOLDSVIS DAPI, Pecam-1 og Sm22α. For hver kanal blev alle billederne taget med de samme indstillinger og eksponeringstid. Udfør mindst tre uafhængige eksperimenter for at opnå biologiske triplikater.

3. Knock out af Sneglen ved hjælp af CRISPR/Cas9 redigering

  1. Design to uafhængige sgRNA'er rettet mod murine Snail.
    1. Design sgRNA'er ved hjælp af onlineværktøjerne CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/) og Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) i henhold til det målrettede gennavn og arter.
    2. Forudsige off-target aktiviteten af de designede sgRNA'er, der er målrettet mod Snail med to uafhængige algoritmer, herunder Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) og CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/).
    3. Vælg to sgRNA'er med den laveste off-activity. Design to komplementære sgRNA oligos med BveI cut site. Følelsen oligo starter med 5'-ACCG-3', og antisense oligo starter med 5'-AAAC-3'.
    4. Bestil oligos at være kommercielt syntetiseret til videre brug.
  2. Klon den komplementære guide RNA oligos i BveI-fordøjet AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer Lentiviral vektor plasmid at generateAA19 pLKO.1-Snail-sgRNA16.
    1. Skær AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer plasmid med BveI enzym16. Bland 2 μg AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA. Bve I-stuffer plasmid, 5 μL 10x Buffer O og 5 μL BveI enzym og tilsæt sterilt vand for at nå et samlet volumen på 50 μL.
    2. Vortex og kort spin ned reaktionen mix. Reaktionen inkuberes ved 37 °C i 1 time.
    3. Reaktionsblandingen indlæses på en 1% agarosegel og køres i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE, 50x TAE bestand: 242 g Tris base opløst i vand, 57,1 ml istid eddikesyre, 100 ml 500 mM EDTA (pH 8.0) opløsning, og tilsæt vand til i alt 1 L) buffer, indtil en god adskillelse er opnået.
    4. Skær rygradsfragmentet ud af gelen, isoler det med et geludtrækningssæt i henhold til producentens protokol (se materialetabellen),og eluer rygraden i 40 μL elueringsbuffer (EB).
    5. Der blandes 5 μL 100 pmol/μL sanse oligo og 5 μL på 100 pmol/μl antisense oligo med 1 μL på 1 M Tris-HCl (pH 8.0) og tilsættes sterilt vand for at nå i alt 100 μL for at anneal gRNA oligos. Blandingen inkuberes i 5 min ved 100 °C, og derefter dække rørene med aluminiumsfolie. Derefter afkøles opløsningen langsomt til stuetemperatur til videre brug som indsats.
    6. For at ligate den komplementære gRNA oligos og BveI-fordøjet rygrad, 1 μL isoleret BveI cut AA19 pLKO.1-puro.U6.sgRNA.BveI-stuffer backbone og 2 μL skær (fortyndet 1:300) med 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μL T4 DNA ligase og tilsæt sterilt vand for at nå i alt 20 μL. Drej kort røret, og inkuber det i 4 timer ved stuetemperatur til videre brug.
      BEMÆRK: Når du udfører ligationen, skal du sikre dig, at der er inkluderet to kontrolgrupper. For en kontrolgruppe blandes 1 μL isoleret rygrad, 2 μL 10x T4 DNA ligase buffer og 1 μL T4 DNA ligase og tilsæt sterilt vand for at nå i alt 20 μL, men uden oligo DNA. For den anden kontrolgruppe blandes 1 μL isoleret rygrad og 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, og der tilsættes sterilt vand for at nå op på i alt 20 μL, men uden de udglødede oligoer og T4 ligase. Disse to kontrol ligationer bruges til at bestemme reaktionen baggrunden i næste transformation skridt og angive, hvor effektiv ligationen er.
  3. Omdan reaktionsblandingen til kompetent TOP10 E. coli.
    1. Indsaml den kompetente TOP10 E. coli. celler fra fryseren -80 °C og tø dem op på is.
    2. Der tilsættes 2 μL ligationblanding til 50 μL kompetente celler, og røret holdes på is i 30 min.
    3. Røret opvarmes ved 42 °C i 30 s. Sæt røret på is i 2 min.
    4. Der tilsættes 950 μL frisk lysogi bouillon (LB) medium til blandingen og rystes kraftigt ved 37 °C i 60 min.
    5. Spin down og plade cellerne på en varm ampicillin (100 μg/mL) modstand LB plade. Pladen inkuberes ved 37 °C natten over.
  4. Kontroller, at gRNA-oligoerne er blevet indsat i plasmidet.
    1. Der plukkes 3-5 kolonier på pladen i 1 mL ampicillin (100 μg/mL), der indeholder LB-medium, og ryst natten over ved 30 °C.
    2. Isoler plasmid-DNA'et med et plasmidsæt i henhold til producentens protokol (Tabel over materialer) og sekvensér det med U6-promotorprimeren 5'- GAGGGCCTATTTCCCATGATT -3' for at verificere den vellykkede indsættelse af gRNA-oligo.

4. Generer Snail knockout MS-1 celler

  1. Producere lentivirale partikler transporterer Cas9 eller Snail-målretning gRNA'er.
    1. 293T-celler i DMEM indeholdende 10% føtalt kvægserum og 100 U/mL penicillin/streptomycin i 14,5 cm retter (eller T75-kolber) i en inkubator (5% CO2, 37 °C).
    2. 9,9 μg målretning af genplasmid, AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA eller pLV-Cas917 plasmid, sammen med hjælperen plasmider 3,5 μg pCMV-VSVG (kodning af G-proteinet fra vesikulær stomatitisvirus, VSV-G), 6,6 μg rev-responsive element plasmid pMDLg-RRE (kodning Gag og Pol), og 5,0 μg pRSV-REV (kodning Rev) i 500 μL serumfri medium. 50 μL polyethylenimin (PEI) (2,5 mg/mL) er blevet opsnæret i 500 μL serumfrit medium. Bland forsigtigt plasmider og PEI-præparater ved at pipette op og ned. Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur.
    3. Transfekt HEK 293T celler ved at tilføje blandingen medium fra trin 4.1.2 til 80% sammenflydende celler i 14,5 cm retter (eller T75 kolber), som indeholder DMEM medium med 10% FBS og 100 U / mL penicillin / streptomycin. HEK293T celler bruges, fordi de er let transfected og generere høje niveauer af virus18.
    4. Overfør transfected HEK 293T celler til en biosikkerhed i mikrobiologisk og biomedicinsk laboratorium (BMBL) for at dyrke dem i 24 timer.
    5. I et BMBL-laboratorium skal transfektmediet udskiftes fra HEK 293T-celler med 12 ml frisk komplet DMEM indeholdende FBS og penicillin/streptomycin. Inkuber cellerne i 24 timer.
    6. Mediet opsamles og filtreres med en 20 mL sprøjte og et 0,45 μm filter. Det betingede medium overføres til et 15 mL polypropylenrør.
    7. Der tilsættes 12 ml frisk komplet DMEM indeholdende FBS og penicillin/streptomycin til HEK 293T kulturret og kultur i yderligere 24 timer.
    8. Mediet opsamles og filtreres med en 20 mL sprøjte og et 0,45 μm filter. Det betingede medium overføres til et 15 mL polypropylenrør. Det medium, der indeholder lentivirale partikler, opbevares som 1 mL aliquots ved -80 °C til videre brug.
  2. Inficere MS-1 celler med pLV-Cas9 virus.
    1. Frø 1 x 105 MS-1 celler per brønd i en 6-brønd plade i 24 timer før lentivirus infektion.
    2. De frosne aliquots af pLV-Cas9-virus optøes i et 37 °C vandbad.
    3. Der blandes 1 ml virusmedium med 1 ml frisk DMEM-medium indeholdende FBS og penicillin/streptomycin. Polybrene til mediet (endelig koncentration som 10 μg/mL) for at øge infektionseffektiviteten.
    4. Fjern mediet fra 6-brøndspladen og udskift det med virus/polybrene mix medium og kultur cellerne i en inkubator i 24 timer. 24 timer efter infektion, udskift mediet med frisk medium og kultur cellerne i yderligere 24 timer.
      BEMÆRK: Hold altid en uinficeret brønd som en kontrolgruppe.
    5. Indsug mediet fra den inficerede gruppe og kontrolgruppe og udskift det med DMEM-medium med 4 μg/mL blasticidin.
    6. Pladen returneres til en 37 °C inkubator, og cellerne dyrkes i 1 uge. Uinficerede celler vil dø på grund af effekten af blasticidin. Split de overlevende celler, når de når 80% celle sammenløb og fortsætte med blasticidin udvælgelse.
    7. Bekræft udtrykket af Cas9 i MS-1 celler ved vestlig blotting ved hjælp af et antistof mod Cas9 (molekylvægt af Cas9 er ca 160 kDa).
  3. Infektiøse pLV-Cas9 MS-1-celler separat med to uafhængige gRNA-lentivirus.
    1. Frø 1 x 105 pLV-Cas9 MS-1 celler per brønd i en 6-brønd plade i 24 timer før infektion.
    2. Følg den samme protokol som beskrevet i 4.2 for at inficere celler med to gRNA-lentivirus separat.
    3. Efter 24 timers infektion med gRNA-virus, opdatere mediet og kultur cellerne i yderligere 24 timer.
    4. Mediet udskiftes med DMEM med 1 μg/mL puromycin. Pladen returneres til en 37 °C inkubator, og cellerne dyrkes i 1 uge. Sørg for, at de uinficerede celler er helt døde. Opdel cellerne, når de når 80% sammenløb og fortsætte puromycin udvælgelse.
    5. Bekræft knock-out af Snegl i MS-1 celler ved vestlig blotting ved hjælp af et antistof mod Snail (molekylær vægt snegl er ca 35 kDa).

Representative Results

TGF-β2 fremkalder EndMT og stimulerer snegleudtryk i MS-1 endotelceller
TGF-β er en af de cytokiner med størst potentiale til at fremkalde EndMT. Efter at have behandlet MS-1-celler med TGF-β2 (1 ng/mL) i 3 dage mister endotelCELLERNE MS-1 deres brostenslignende struktur og differentierer sig til spindelformede mesenchymale celler (Figur 1A)15. For yderligere at kontrollere TGF-β2's rolle i inducerende cellefenotypiske ændringer behandlede vi cellerne med det lille molekyle activin receptor-lignende kinase (ALK)4/ALK5/ALK7-hæmmer SB431542 før TGF-β2 stimulation19. SB431542 fuldstændigt ophævet TGF-β2-induceret cellemorfologi ændringer (Figur 1A). Den TGF-β2 inducerede EndMT-proces blev yderligere undersøgt ved at undersøge ændringer i udtrykket af EndMT-relaterede markører. Som det fremgår af figur 1B, blev det endotelprotein Pecam-1 kraftigt reduceret efter TGF-β2-stimulering, mens den mesenchymale faktor Sm22α var dybt reguleret af TGF-β215. Disse data er i overensstemmelse med forestillingen om, at TGF-β2 udløste EndMT i MS-1-celler. Dernæst undersøgte vi virkningerne af TGF-β2 på Snegle- og snegleudtryk. Som vist i figur 1Cblev Sneglen markant reguleret af TGF-β2, mens Slug-udtrykket ikke var påvirket af TGF-β2 i MS-1-celler15. Kvantificeringen af snegleudtryk fra tre uafhængige eksperimenter er vist i figur 1D.

Crispr/Cas9's udtømning af snegle i MS-1 endotelceller
Da Snail blev induceret af TGF-β2 og sandsynligvis involveret i TGF-β2-medieret EndMT, udførte vi CRISPR/Cas9 genredigering til genetisk nedbrydende snegleudtryk i MS-1-celler. Vi hypotese, at udtømning af Snail ville være tilstrækkelig til at hæmme TGF-β2-induceret EndMT. Som vist i figur 2Agenererede vi Snail knockout celler i to trin. For det første blev Cas9 ektopisk udtrykt ved at inficere MS-1-celler med en Cas9, der udtrykte lentivirus. Da der er en blasticidin modstand kassette i pLV-Cas9 konstruere, vi kontrolleret udtryk for Cas9 af vestlige blot analyse i blasticidin resistente celler (Figur 2D). Efterfølgende introducerede vi sgRNA'er, der specifikt var målrettet Snail for at forstyrre dets proteinudtryk. Denne procedure blev også udført ved infektion med lentivirale partikler, der bærer AA19 pLKO.1-Snail-sgRNA-konstruktionen, som omfatter en puromycinudtrykkassette. Cas9-udtrykkende celler blev igen inficeret med gRNA indeholdende lentivirus og yderligere udvalgt med puromycin. To komplementære sgRNA-oligoer rettet mod murine sneglen blev designet med en forventet lav off-target aktivitet(figur 2B, C). Efter at have introduceret to uafhængige Snail sgRNA'er i Cas9, der udtrykker MS-1-celler, blev Snail proteinudtryk ophævet (Figur 2D)15.

Mangel på snegl hæmmer TGF-β2-induceret EndMT i MS-1 celler
For at demonstrere sneglens funktion i TGF-β2-medieret EndMT udførte vi en EndMT-analyse i snail-udtømte celler og sammenlignede den med forældre MS-1-celler. Som vist i figur 3Avar knockoutet af Snail tilstrækkeligt til at hæmme den fibroblastlignende cellemorfologi drevet af TGF-β2 i MS-1-celler15. Desuden blev TGF-β2-medieret nedgang i Pecam-1 og forbedring af Sm22α fuldstændig blokeret i Snail-udtømte MS-1 celler. Sammenfattende viste vi, at Snegl er kritisk for TGF-β2-medieret EndMT i MS-1 celler (Figur 3B)15.

Figure 1
Figur 1. TGF-β2 fremkalder EndMT og Snail udtryk i MS-1 celler. A. Det er ikke så lidt. Virkninger af TGF-β2 og/eller TGF-β type I receptor kinase inhibitor SB-431542 på cellemorfologi. Brightfield billeder af MS-1 celler ved behandling med TGF-β2 (1 ng/mL) og/eller SB-431542 (SB, 5 μM, administreret 30 min før TGF-β2) i 2 dage. Skalalinjen repræsenterer 200 μm. Immunfluorescens farvning af Pecam-1 (grøn) og Sm22α (rød) i MS-1 celler dyrket i medium indeholdende TGF-β2 (1 ng/mL) i 3 dage. Nuclei visualiseres med blåt (DAPI). Skalabjælke: 50 μm. C. Vestlig skamplet med helcellelysat af TGF-β2 stimulerede MS-1-celler. Udtrykket snail, men ikke slug, blev forstærket af TGF-β2 stimulation, som tidligere rapporteret i Ma et al15. D. Det er mig. Kvantificering af snegleudtryk ved at integrere resultaterne fra tre uafhængige vestlige blot eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Udtømning af snegle ved CRISPR-Cas9 genredigering. A. Det er ikke så lidt. Ordning, der skildrer, hvordan man genererer Snail knockout celler. Bsd: Blasticidin. Puro: Puromycin. B. Oligonukleotider af to uafhængige sgRNA'er rettet mod snegle ved hjælp af CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) og Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). C. Den forventede off-target aktivitet af de to gRNA'er for Snail ved hjælp af Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/). D. Det er mig. Cas9 og Snail udtryk i vilde type (WT) og Cas9-overekspresseret MS-1 målt ved Western blot analyse. E. Knockout af Snail med to uafhængige gRNA'er i MS-1 celler målt ved Western blot analyse. Vi rapporterede lignende resultater i Ma etal. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Genetisk udtømning af snegle hæmmer TGF-β2-induceret EndMT i MS-1 celler. A. Det er ikke så lidt. Brightfield billeder af MS-1 celler ved behandling med TGF-β2 (0,1 ng/mL) i 3 dage i wildtype (WT, øverste panel) og Snail slået ud (lavere panel) celler. Skalabjælke repræsenterer 200 μm. B. Immunfluorescentfarvning for Pecam-1 (grøn), Sm22α (rød) og kerne (blå) af MS-1 celler dyrket i medium indeholdende TGF-β2 (1 ng/mL) i 3 dage. Udtømning af Snail ophævet TGF-β2-induceret fald i Pecam-1 og stigning i Sm22α udtryk. Skalalinjen repræsenterer 50 μm. C. Skematisk repræsentation af effekten af Snegle knockout på TGF-β-induceret EndMT i MS-1 celler. TGF-β stimulerer udtrykket af snegl gennem Smad vej ved fosforierende Smad2/3 og yderligere drev EndMT. Knocking out Snail ved hjælp af CRISPR/Cas9-baseret genredigering ophævet TGF-β-medieret EndMT. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Forståelse af endmt-mekanismen er afgørende for at modulere denne proces og målrette EndMT-relaterede sygdomme. Her beskrev vi metoder til at udføre en TGF-β-induceret EndMT-analyse og afhøre rollen som EndMT-TF Snail i TGF-β-udløst EndMT ved at udføre CRISPR/Cas9-medieret stabil genudtømning af snegl fra celler. Udtømningen af Sneglen ved hjælp af CRISPR/Cas9-metoden ophævede med succes TGF-β2-drevet EndMT i MS-1-celler (Figur 3C). For at undersøge virkningerne af cytokiner, som TGF-β, på EndMT, blev ECs udsat for cytokiner, og derefter blev forekomsten af EndMT vurderet i henhold til morfologiske ændringer og endotel- og mesenchymal markørudtryksændringer i celler. TGF-β2 stærkt induceret EndMT i MS-1 celler ledsaget af en stærk stigning i udtrykket af transskription faktor Snail. EndMT-TF'erne, der er fremkaldt af TGF-β, kan variere alt efter art eller vævsspecifik endotelcelletype. For eksempel observerede vi, at Snail, men ikke Slug, blev signifikant reguleret af TGF-β i MS-1-celler, mens både snegle og snegle i menneskelige navlestrengs-endothelialceller (HUVECs) øges efter eksponering for TGF-β20.

Vi vurderede omfanget af EndMT-processen på to måder ved at undersøge cellemorfologiændringer og derefter ved at undersøge ændringer i EndMT-relaterede markører udtryk. Efter TGF-β eksponering i 3 dage gennemgik celler endmt med konsekvente morfologiske variationer og ændringer i udtrykket af EndMT-relaterede markører. Ud over den immunfluorescens farvning, vi udførte her, kan markørvariationer også overvåges ved vestlig blotting på proteinudtryksniveau eller ved qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR) vedgenniveauerne 21. Ud over disse to tids- og omkostningsbesparende metoder, som vi viste i denne protokol, er der andre metoder til at undersøge EndMT. Hvis du f.eks. udfører transskriptionsanalyse (ved RNA-sekventering eller qPCR) for at sammenligne udtryksniveauerne for endotel- og mesenchymale-relaterede gener mellem behandlede celler ogkontrolceller,kan du præcist vurdere EndMT22,23. Derudover indebærer EndMT ofte et stabilt tab af barrierefunktion, som kan vurderes ved impedansspektroskopi24. Desuden kan yderligere dokumentation for endmt-afledte cellers erhvervelse af stamcellelignende egenskaber undersøges. For eksempel kan EndMT mesenchymal-lignende celler under særlige kulturforhold differentieres yderligere i osteoblaster, chondrocytter, adipocytter eller (myo)fibroblaster. Derfor er yderligere analyse for at bekræfte differentieringen i forskellige celletyper, der tilhører mesoderm-slægten (dvs. genekspression og matrixfarvning), nyttig til påvisning af endmt-afledte cellers multipotente karakter. Endelig er EndMT-vurderingsmetoderne ikke begrænset til in vitro-undersøgelser, men kan ekstrapoleres for at undersøge forholdet mellem EndMT og visse sygdomme in vivo eller i ex vivo-organer. I den forstand udvides brugen af endotelspecifikke sporingsstrategier for afstamning bredt til EndMT-relateret forskning25.

For at undersøge Snails rolle under EndMT blev CRISPR/Cas9-genredigering i denne undersøgelse brugt til at slå dette gen ud. Dataene viste, at TGF-β2 ikke kunne mægle EndMT i Snail mangelfuld MS-1 celler. Denne observation viste, at Snegl er afgørende for TGF-β2 induceret EndMT i MS-1 celler. Vi brugte en uafhængig U6-drevet sgRNA-udtrykskassette til at introducere specifikke sgRNA'er til Cas9 for at målrette snail. Ud over denne metode beskrev Ran et al.26 en anden strategi for kloning af sgRNA oligos-sekvensen i Cas9-stilladset for at generere en konstruktion, der indeholder både Cas9 og gRNA'er. Nye tilgange gør det muligt for CRISPR/Cas at indarbejde yderligere funktioner. For eksempel kan dobbelt eller tredobbelt knockouts opnås ved at levere flere sgRNA'er i celler, der udtrykker Cas927. Den manipulerede Cas13 protein mål og fordøjer RNA molekyler uden at forstyrre endogene DNA28. Udover at slå gener ud med CRISPR/Cas, kan korte hårnåle-RNA'er (shRNA'er) bruges som alternativer til at slå målrettet genekspression29ned. For alle CRISPR/Cas-genredigeringsmetoder bør der altid tages hensyn til kavalergang uden for målet. Derudover fortyndes små forstyrrende RNA'er (siRNA'er) forbigående stilhedsgenudtryk, og siRNA-koncentrationen fortyndes med celledeling30. Begge disse metoder undertrykker delvist målrettet genekspression. I modsætning hertil bruges ektopisk genekspression også til at verificere genfunktion under EndMT/EMT31. Denne tilgang kan afgøre, om opreguleringen af et gen er tilstrækkelig til at fremkalde en EndMT-respons. Derfor er der i øjeblikket en lang række tekniske strategier, der kan bruges til at identificere og verificere potentielle regulatorer af EndMT. Desuden kan transskriptionsanalyse være en god mulighed i identifikationen og omfattende analyse af EndMT-relaterede tilsynsmyndigheder. Vi anbefaler, at du bruger forskellige komplementære tilgange til at undersøge gradueringen af EndMT.

Sammenfattende introducerede vi en arbejdsgang for at identificere faktorer, der kan spille funktionelle roller under TGF-β-induceret EndMT. Denne metode kan også bruges til at undersøge, om andre stimuli (dvs. cytokiner, vækstfaktorer, mekaniske stimuli, cellecelleinteraktioner) kan modulere EndMT og samspillet mellem TGF-β med andre stimuli. Derudover fremhævede vi en tilgang ved hjælp af CRIPSR / Cas-genredigering for at belyse, om et bestemt gen er påkrævet for TGF-β-induceret EndMT. For at illustrere denne metode brugte vi den stærke EndMT-inducer TGF-β2 i MS-1-celler, men protokollerne kan tilpasses andre cytokiner og andre celletyper. Vi forventer, at denne detaljerede protokol, der er beskrevet, vil tjene som et springbræt til fremtidige EndMT-relaterede undersøgelser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskningen blev støttet af CGC.NL og det hollandske kardio vaskulære forskningsinitiativ: Dutch Heart Foundation, den hollandske sammenslutning af medicinske universitetscentre, den nederlandske organisation for sundhedsforskning og -udvikling og Royal Netherlands Academy of Sciences Grant tildelt Phaedra-Impact (http://www.phaedraresearch.nl). JM støttes af det kinesiske stipendieråd. GSD støttes af et trampolintilskud fra AFM-Telethon [22379], FOP Italia og et tilskud fra La Fundació La Marató de TV3 (#202038).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter Pall Corporation, USA 4614
10× T4 DNA ligase buffer Thermofisher Scientific, USA B69
12 mm round glass slice Knittel Glass,Germany VD10012Y1A.01
20 mL syringe BD Eclipse, USA 300629
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories, USA H-1200 VECTASHIELD Antifade Mounting Media
AA19_PLKO vector Dr. M Gonçalves, Leiden University Medical Center, Netherlands Gift
Ampicillin Serva Electrophoresis, USA 1339903
Anti-Mouse IgG GE Healthcare, USA NA931
Anti-Rabbit IgG Cell signaling, USA 7074
Agarose Roche, Switzerland 11388991001
Blasticidin Invitrogen, USA R21001
Buffer O (10X) Thermofisher Scientific, USA BO5
BveI (Bspm1) Thermofisher Scientific, USA ER 1741
Confocal microscope Leica Microsystems, Germany SP8
DMEM  Thermo Fisher Scientific, USA 11965092
Donkey anti-rat Alexa 488  Invitrogen, USA A21208
FBS  Thermo Fisher Scientific, USA 16000044
Formaldehyde  Thermo Fisher Scientific, USA 28908
Inverted microscope Leica Microsystems, Germany DMi8
Goat anti-rabbit Alexa 594  Invitrogen,USA A11012
LabNed Plasmid kit LabNed, USA LN2400004
MS-1 cell line American Type Culture Collection (ATCC)
Nail polish HEMA, Netherlands Transparent
Pecam-1 antibody  Becton Dickinson,USA 553370
PEI Polysciences, USA 23966-1
PLV-Cas9 plasmid Sigma-Aldrich, USA Cas9BST-1EA
Puromycin Sigma-Aldrich, USA P9620
QIAquick gel extraction kit Qiagen, Germany 28706
Sm22a antibody  Abcam, UK ab14106
Snail Cell signaling, USA 3879
T4 DNA ligase Thermofisher Scientific, USA EL 0014
TC20 automated Cell Counter Bio-Rad, USA 1450102
Human TGF-β2 Joachim Nickel, University of Wurzburg Gift Other commercial recommendation: 302-B2, R&D systems
Triton X-100 Merck, USA 1086031000
SB431542 Tocris Bioscience, UK 1614
Tris Roche, Switzerland 11814273001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, J., Sanchez-Duffhues, G., Goumans, M. -J., Ten Dijke, P. TGF-β-induced endothelial to mesenchymal transition in disease and tissue engineering. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  2. Piera-Velazquez, S., Jimenez, S. A. Endothelial to mesenchymal transition: role in physiology and in the pathogenesis of human diseases. Physiological Reviews. 99 (2), 1281-1324 (2019).
  3. Sánchez-Duffhues, G., de Vinuesa, G. A., ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. 247 (3), 492-508 (2018).
  4. Evrard, S. M., et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability. Nature Communications. 7 (1), 1-16 (2016).
  5. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  6. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  7. Clere, N., Renault, S., Corre, I. Endothelial-to-mesenchymal transition in cancer. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
  8. Saito, A. EMT and EndMT: regulated in similar ways. The Journal of Biochemistry. 153 (6), 493-495 (2013).
  9. Bolós, V., et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. Journal of Cell Science. 116 (3), 499-511 (2003).
  10. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), 006429 (2012).
  11. Yang, J., et al. Guidelines and definitions for research on epithelial-mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , 1-12 (2020).
  12. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
  13. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  14. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic H-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 94 (3), 861-866 (1997).
  15. MA, J., et al. TGF-?-induced endothelial to mesenchymal transition results from a balance between SNAIL and ID factors. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 182 (9), (2021).
  16. Chen, X., et al. Probing the impact of chromatin conformation on genome editing tools. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6482-6492 (2016).
  17. Hunter, F. W., et al. Functional CRISPR and shRNA screens identify involvement of mitochondrial electron transport in the activation of evofosfamide. Molecular Pharmacology. 95 (6), 638-651 (2019).
  18. Mao, Y., et al. Lentiviral vectors mediate long-term and high efficiency transgene expression in HEK 293T cells. International Journal of Medical Sciences. 12 (5), 407 (2015).
  19. Liu, S., et al. Deubiquitinase activity profiling identifies UCHL1 as a candidate oncoprotein that promotes TGFβ-induced breast cancer metastasis. Clinical Cancer Research. 26 (6), 1460-1473 (2020).
  20. Medici, D., et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nature Medicine. 16 (12), 1400 (2010).
  21. Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFβ-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
  22. Dong, J., et al. Single-cell RNA-seq analysis unveils a prevalent epithelial/mesenchymal hybrid state during mouse organogenesis. Genome Biology. 19 (1), 1-20 (2018).
  23. Oatley, M., et al. Single-cell transcriptomics identifies CD44 as a marker and regulator of endothelial to haematopoietic transition. Nature communications. 11 (1), 1-18 (2020).
  24. Halaidych, V., et al. Inflammatory responses and barrier function of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (5), 1642-1656 (2018).
  25. Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases. Nature Reviews Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).
  26. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  27. Grav, L. M., et al. One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal. 10 (9), 1446-1456 (2015).
  28. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).
  29. Paddison, P. J., et al. Cloning of short hairpin RNAs for gene knockdown in mammalian cells. Nature Methods. 1 (2), 163-167 (2004).
  30. Reynolds, A., et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 22 (3), 326-330 (2004).
  31. Lourenço, A. R., et al. C/EBPɑ is crucial determinant of epithelial maintenance by preventing epithelial-to-mesenchymal transition. Nature Communications. 11 (1), 1-18 (2020).

Tags

Biologi Problem 168 CRISPR/Cas9 knock-out lentivirus Immunofluorescens MS-1 Snail Slug
TGF-β medieret endotel til mesenchymal overgang (EndMT) og funktionel vurdering af EndMT-effektorer ved hjælp af CRISPR/Cas9-genredigering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, J., van der Zon, G.,… More

Ma, J., van der Zon, G., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. TGF-β-mediated Endothelial to Mesenchymal Transition (EndMT) and the Functional Assessment of EndMT Effectors using CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (168), e62198, doi:10.3791/62198 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter