通过代谢标记和薄层色谱分析 糖浆 中中性脂质合成
Summary
在这里，为酵母的代谢标记提供 14个C-醋酸，这与薄层色谱相结合，用于中性脂质的分离。
Abstract
中性脂质 （NLs） 是一类疏水、无电荷的生物分子，在能量和脂质平衡中起着关键作用。NLs 由乙酰-CoA 合成，主要以甘油三酯 （TGs） 和固醇酯 （SEs） 的形式存在于真核生物中。负责合成NL的酶从 糖精 （酵母）高度保存到人类，使酵母成为解剖NL代谢酶的功能和调节的有用模型有机体。虽然人们对于乙酰-CoA如何转化为一组不同的NL物种还知之甚少，但调节NL代谢酶的机制，以及错误调节如何促成细胞病理学，仍在被发现。经过几十年的研究，已经开发并使用了许多分离和描述NL物种的方法：然而，尚未讨论对主要NL物种进行综合表征的定量和简单协议。在这里，提出了一个简单和适应性强的方法来量化酵母中主要NL物种的合成。我们应用 14个C-醋酸代谢标记加上薄层色谱来分离和量化各种生理上重要的NL。 此外，这种方法可以很容易地应用于研究NL酶的体内反应率或NL物种的退化随着时间的推移。
Introduction
乙酰-CoA是包括中性脂质（NLs）在内的多种生物分子的基本组成部分，它作为一种多功能的生物分子货币，用于制造膜、生成ATP和调节细胞信号1，2。将 NLs 分流到任何这些相应路径的可用性部分受其存储管理。脂质液滴（LDs），由甘油三酯（TGs）和固醇酯（SEs）的疏水核心组成的细胞质细胞器，是大多数细胞NL的主要储存室。因此，LDs封存和调节NL，它可以降解，随后用于生化和代谢过程3，4。据了解，NL和LD相关蛋白质的误调与病理学的发病有关，包括脂质萎缩和代谢综合征5、6。因此，目前的LD研究主要集中在NL合成如何在空间、时间和跨多细胞生物的不同组织中进行调节。由于 NL 的细胞作用无处不在，许多负责 NL 合成和调节的酶在整个真核生物7中都得到保存。事实上，甚至一些前卡约特人存储NLs在LDs8。因此，基因可通导模型生物，如糖核酸菌（芽酵母），对NL合成和调控的研究很有用。
NL与细胞提取物的分离和量化可以通过多种途径完成，包括气相色谱-质谱（GC-MS）、高性能液相色谱（HPLC）和超高性能液相色谱质谱（UPLC-MS）9、10、11。也许分离 NLs 的最简单方法是通过薄层色谱 （TLC）， 这允许随后的密度计量定量从标准曲线12，13.虽然 TLC 只提供 NL 的课程粒式分离，但它仍然是一种强大的技术，因为它价格低廉，并且允许 NL 同时从多个样本中快速分离。通过TLC研究NL面临的两个最重大的挑战是：1） NL物种及其中间体的细胞丰度范围广，2） NL合成通路内脂质中间体的亲水性/疏水性范围。因此，通过TLC对NL物种的量化通常仅限于最丰富的物种：然而，引入14个C-醋酸放射性标签可以显著增强NL通路内低丰度中间体的检测。乙酰酸通过乙酰-CoA合成酶ACS214迅速转化为乙酰-CoA，使14C-醋酸成为酵母15中合适的放射性标签基板。此外，TLC可以通过使用多个溶剂系统16实现疏水性NL和NL亲水中间体的分离。在这里，使用酵母中的14个 C-醋酸代谢标记提出了分离 NLs 的方法。脉冲期标记的脂质随后被一个成熟的总脂质隔离协议17隔离，然后由TLC分离NL物种。通过自传开发TLC板，可视化标记的脂质，以及化学喷雾可视化总脂质，允许多种量化方法。使用剃须刀刀片也很容易从 TLC 板中提取单个脂质带，并且可以使用闪烁计数来量化带内的放射性标签材料量。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，提出了一个通用的无线电标签协议，以定量监测酵母中NL物种的合成。此协议非常模块化，允许在 3-6 天内完成该程序。此外，有丰富的文献存在使用TLC分离脂质物种和代谢物，这应该允许用户检测几个脂质物种的兴趣与TLC溶剂系统16，19的简单变化。此协议有利于放射性标签脂质的分离、检测和量化。它还可以与无标签介质中的追逐期相结合，…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢亨尼实验室的成员在完成这项研究时提供帮助和概念建议。W.M.H.得到韦尔奇基金会（I-1873）、NIH NIGMS（GM119768）、阿拉·帕雷斯吉安医学研究基金和UT西南资助学者项目的资金支持。S.R 得到了 T32 计划赠款 （5T32GM008297） 的支持。
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
