대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석
Summary
여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
중성 지질 (LL)은 에너지와 지질 항상성에 중요한 역할을하는 소수성, 불책임한 생체 분자의 클래스입니다. LLs는 아세틸-CoA로부터 합성드 노보이며 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 형태로 주로 진핵생물에 존재한다. LL의 합성을 담당하는 효소는 Saccharomyces cerevisiae (효모)에서 인간에게 매우 보존되어 효모는 NL 신진 대사 효소의 기능과 조절을 해부하는 유용한 모델 유기체입니다. 아세틸-CoA가 다양한 NL 종으로 변환되는 방법에 대해 많은 알려져 있지만, NL 대사 효소를 조절하기 위한 메커니즘, 그리고 잘못된 규제가 세포 병리학에 어떻게 기여할 수 있는지에 대해서는 여전히 발견되고 있습니다. NL 종의 고립과 특성화를 위한 수많은 방법은 수십 년 동안 연구를 통해 개발되고 사용되었습니다. 그러나 주요 NL 종의 포괄적인 특성화를 위한 정량적이고 단순한 프로토콜은 논의되지 않았습니다. 여기서, 효모에서 주요 NL 종의 드 노보 합성을 정량화하는 간단하고 적응 가능한 방법이 제시된다. 우리는 얇은 층 크로마토그래피와 결합 된 14C-아세트산 대사 라벨링을 적용하여 다양한 생리학적으로 중요한 LL을 분리하고 정량화합니다.
Introduction
아세틸-코아는 중성 지질(LL)을 포함한 다양한 생체분자의 기본 구성 블록으로, 멤브레인 을 구축하고 ATP를 생성하며 세포 신호1,2를조절하는 다목적 생체 분자 통화로 작용한다. 이러한 각 경로 중 어느 경로로든 LS를 회피할 수 있는 가용성은 부분적으로 스토리지에 의해 규제됩니다. 지질 방울(LDs), 트리글리세라이드(TGs) 및 스테롤 에스테르(SEs)의 소수성 코어로 구성된 세포질 세포기관은 대부분의 셀룰러 LL의 주요 저장 칸입니다. 이와 같이, LDs 격리 및 조절 LL, 이는 저하 될 수 있으며, 그 후 생화학 및 신진 대사과정에활용3,4. NL 및 LD 관련 단백질의 잘못된 조절은 lipodystrophy 및 대사 증후군5,6을포함하여 병리학의 개시와 상관관계가 있는 것으로 알려져 있습니다. 이 때문에, 현재 LD 연구는 NL 합성이 공간적으로, 현세적으로, 그리고 다세포 유기체의 뚜렷한 조직에 걸쳐 어떻게 규제되는지에 집중됩니다. LL에 대한 유비쿼터스 세포 역할로 인해 LL의 합성 및 조절을 담당하는 많은 효소가 진핵생물7을통해 보존됩니다. 실제로 일부 prokaryotes도 LDS8에L을 저장합니다. 따라서, Saccharomyces cerevisiae (신진 효모)와 같은 유전적 인 기관체는 NL 합성 및 조절의 연구에 유용했습니다.
세포 추출물로부터의 LL의 분리 및 정량화는 가스 크로마토그래피 질량 분석법(GC-MS), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 질량 분석법(UPLC-MS)9,10,11을포함한 무수한 방법으로 달성될 수 있다. 아마도 LL을 분리하는 가장 간단한 방법은 표준곡선(12,13)에서후속 밀도 정량화를 허용하는 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 통해서일 수 있다. TLC는 L의 코스 그레인 분리만 제공하지만 저렴하기 때문에 강력한 기술로 남아 있으며 여러 샘플에서 동시에 L을 신속하게 분리할 수 있습니다. TLC를 통해 LL의 연구에 직면 하는 가장 상당한 과제의 두 가지는: 1) NL 종 및 그들의 중간체의 세포 풍부의 광범위 한 범위, 그리고 2) NL 합성 경로 내에서 지질 중간체의 소수성/소수성의 범위. 따라서, TLC를 통해 NL 종의 정량화는 일반적으로 가장 풍부한 종으로 제한됩니다; 그러나, 14C-아세트산 방사성 라벨의 도입은 NL 경로 내에서 낮은 풍부 중간체의 검출을 크게 향상시킬 수 있습니다. 아세트산은 아세틸-코아 시냅스 ACS214에의해 아세틸-코아로 빠르게 변환되어, 이는 14C-아세트산을 효모15에서적합한 방사성 라벨기질로 만든다. 또한, 다수의 용매시스템(16)을사용하여 TLC에 의해 소수성 LL 및 LL의 친성 중급자 모두의 분리를 달성할 수 있다. 여기서, 효모에서 14C-아세트산 대사 라벨링을 사용하여 LL의 분리를 위한 방법이 제시된다. 펄스 기간 동안 표지된 지질은 그 후 잘 확립된 총 지질 격리프로토콜(17)에의해 격리되고, 그 다음으로 TLC에 의한 NL 종의 분리가 뒤따릅니다. 라벨이 부착된 지질을 시각화하기 위해 사인 방사선 촬영으로 TLC 플레이트를 개발하고 총 지질을 시각화하는 화학 스프레이를 개발하여 여러 가지 정량화 방법을 허용합니다. 개별 지질 밴드는 또한 면도날을 사용하여 TLC 플레이트에서 쉽게 추출할 수 있으며, 신경화 계수는 밴드 내의 방사성 라벨 재료의 양을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 효모에서 NL 종의 합성을 정량적으로 모니터링하는 다목적 방사성 라벨링 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 매우 모듈식이므로 3-6 일 이내에 절차를 완료 할 수 있습니다. 또한, TLC 용매시스템(16,19)의간단한 변화와 함께 관심 있는 여러 지질 종을 검출할 수 있도록 하는 지질종과 대사산물을 분리하기 위해 TLC를 사용하는 데 많은문헌이존재?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 연구의 완성에 도움이나 개념적 조언을 준 Henne 연구소의 회원들에게 감사를 표하고 싶습니다. W.M.H.는 웰치 재단(I-1873), NIH NIGMS(GM119768), 아라 파레스기 안의학 연구 기금, UT 남서부 인다우먼트 학자 프로그램의 기금으로 지원됩니다. S.R은 T32 프로그램 교부금(5T32GM0008297)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
