Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии
Summary
Здесь представлен протокол метаболической маркировки дрожжей 14С-уксусной кислотой, которая сочетается с тонкослойной хроматографией для разделения нейтральных липидов.
Abstract
Нейтральные липиды (DL) представляют собой класс гидрофобных, незарядующих биомолекул, которые играют ключевую роль в энергетическом и липидном гомеостазе. DL синтезируются de novo из ацетил-КоА и в основном присутствуют у эукариот в виде триглицеридов (ТГ) и стерол-эфиров (ЭС). Ферменты, ответственные за синтез DL, высоко сохраняются от Saccharomyces cerevisiae (дрожжей) до человека, что делает дрожжи полезным модельным организмом для препарирования функции и регуляции ферментов метаболизма NL. Хотя многое известно о том, как ацетил-КоА превращается в разнообразный набор видов NL, механизмы регулирования ферментов метаболизма NL и как неправильная регуляция может способствовать клеточным патологиям, все еще обнаруживаются. Многочисленные методы выделения и характеристики видов NL были разработаны и использованы в течение десятилетий исследований; однако количественный и простой протокол для всеобъемлющей характеристики основных видов НЛ не обсуждался. Здесь представлен простой и адаптируемый метод количественной оценки de novo синтеза основных видов NL в дрожжах. Мы применяем метаболическую маркировку 14С-уксусной кислоты в сочетании с тонкослойной хроматографией для разделения и количественной оценки разнообразного диапазона физиологически важных DL. Кроме того, этот метод может быть легко применен для изучения скорости реакции in vivo ферментов NL или деградации видов NL с течением времени.
Introduction
Ацетил-КоА является фундаментальным строительным блоком различных биомолекул, включая нейтральные липиды (DL), которые служат универсальной биомолекулярной валютой для построения мембран, генерации АТФ и регулирования клеточной сигнализации1,2. Доступность НГ для шунтации в любой из этих соответствующих путей частично регулируется их хранением. Липидные капли (ЛД), цитоплазматические органеллы, состоящие из гидрофобных ядер триглицеридов (ТГ) и эфиров стеролов (ЭС), являются основными хранилищами большинства клеточных НГ. Таким образом, ЛД изолируют и регулируют DL, которые могут быть деградированы и впоследствии использованы для биохимических и метаболических процессов3,4. Известно, что неправильная регуляция NL и LD-ассоциированных белков коррелирует с возникновением патологий, включая липодистрофию и метаболические синдромы5,6. Из-за этого текущие исследования LD интенсивно сосредоточены на том, как синтез NL регулируется пространственно, временно и через различные ткани многоклеточных организмов. Из-за вездесущих клеточных ролей для DL многие ферменты, ответственные за синтез и регуляцию DL, сохраняются во всех эукариотах7. Действительно, даже некоторые прокариоты хранят DL в ЛД8. Поэтому генетически податливые модельные организмы, такие как Saccharomyces cerevisiae (почковые дрожжи), были полезны для изучения синтеза и регуляции NL.
Отделение и количественная оценка DL от клеточных экстрактов могут быть выполнены множеством способов, включая газовую хроматографию-масс-спектрометрию (GC-MS), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и сверхэффективную жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (UPLC-MS)9,10,11. Возможно, самым простым методом разделения DL является тонкослойная хроматография (TLC), которая позволяет проводить последующую денситометрическую количественную оценку из стандартной кривой12,13. Хотя TLC обеспечивает только последовательное разделение DL, он остается мощным методом, поскольку он недорог и позволяет быстро отделить DL от нескольких образцов одновременно. Двумя наиболее значительными проблемами, стоящими перед изучением НЯ с помощью TLC, являются: 1) широкий диапазон клеточных обилий видов NL и их промежуточных продуктов и 2) диапазон гидрофильности/гидрофобности липидных промежуточных продуктов в путях синтеза NL. Следовательно, количественная оценка видов NL с помощью TLC обычно ограничивается наиболее распространенными видами; однако введение радиомарки 14С-уксусной кислоты может значительно улучшить обнаружение промежуточных продуктов с низкой плотностью в путях NL. Уксусная кислота быстро превращается в ацетил-КоА с помощью ацетил-КоА-синтетазы ACS214,что делает 14С-уксусную кислоту подходящим субстратом для радиомаркировки в дрожжах15. Кроме того, разделение как гидрофобных НЯ, так и гидрофильных промежуточных продуктов ЛЛ может быть достигнуто С помощью TLC путем использования нескольких систем растворителей16. Здесь представлен метод разделения НГ с использованием метаболической маркировки 14С-уксусной кислоты в дрожжах. Липиды, меченные в течение импульсного периода, впоследствии выделяются хорошо заядлым протоколом17полной выделения липидов с последующим разделением видов NL по TLC. Разработка пластин TLC с помощью как авторедиографии для визуализации меченых липидов, так и химического спрея для визуализации общего количества липидов позволяет использовать несколько методов количественной оценки. Отдельные липидные полосы также могут быть легко извлечены из пластины TLC с помощью лезвия бритвы, а сцинтилляционный подсчет может быть использован для количественной оценки количества радиомаркированного материала в полосе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь представлен универсальный протокол радиомаркировки для количественного мониторинга синтеза видов NL в дрожжах. Этот протокол очень модульный, что позволяет закончить процедуру в течение 3-6 дней. Кроме того, существует множество литературы по использованию TLC для разделения липи?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Хенне за помощь и концептуальные советы в завершении этого исследования. W.M.H. поддерживается фондами Фонда Уэлча (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Фонда медицинских исследований Ара Паресгиана и Программы стипендиатов Юго-Западного университета Юты. S.R была поддержана грантом программы T32 (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
