Здесь представлен протокол метаболической маркировки дрожжей 14С-уксусной кислотой, которая сочетается с тонкослойной хроматографией для разделения нейтральных липидов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейтральные липиды (DL) представляют собой класс гидрофобных, незарядующих биомолекул, которые играют ключевую роль в энергетическом и липидном гомеостазе. DL синтезируются de novo из ацетил-КоА и в основном присутствуют у эукариот в виде триглицеридов (ТГ) и стерол-эфиров (ЭС). Ферменты, ответственные за синтез DL, высоко сохраняются от Saccharomyces cerevisiae (дрожжей) до человека, что делает дрожжи полезным модельным организмом для препарирования функции и регуляции ферментов метаболизма NL. Хотя многое известно о том, как ацетил-КоА превращается в разнообразный набор видов NL, механизмы регулирования ферментов метаболизма NL и как неправильная регуляция может способствовать клеточным патологиям, все еще обнаруживаются. Многочисленные методы выделения и характеристики видов NL были разработаны и использованы в течение десятилетий исследований; однако количественный и простой протокол для всеобъемлющей характеристики основных видов НЛ не обсуждался. Здесь представлен простой и адаптируемый метод количественной оценки de novo синтеза основных видов NL в дрожжах. Мы применяем метаболическую маркировку 14С-уксусной кислоты в сочетании с тонкослойной хроматографией для разделения и количественной оценки разнообразного диапазона физиологически важных DL. Кроме того, этот метод может быть легко применен для изучения скорости реакции in vivo ферментов NL или деградации видов NL с течением времени.
Введение
Ацетил-КоА является фундаментальным строительным блоком различных биомолекул, включая нейтральные липиды (DL), которые служат универсальной биомолекулярной валютой для построения мембран, генерации АТФ и регулирования клеточной сигнализации1,2. Доступность НГ для шунтации в любой из этих соответствующих путей частично регулируется их хранением. Липидные капли (ЛД), цитоплазматические органеллы, состоящие из гидрофобных ядер триглицеридов (ТГ) и эфиров стеролов (ЭС), являются основными хранилищами большинства клеточных НГ. Таким образом, ЛД изолируют и регулируют DL, которые могут быть деградированы и впоследст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Рост и маркировка дрожжевых клеток 14С-уксусной кислотой
- Инокулируют культуру дрожжей, выбирая колонию из тарелки и распределяя ее в 20 мл синтетических полных (SC) сред, содержащих 2% декстрозы (см. Дополнительный файл для рецепта SC среды). Инкубировать при 30 °C на ночь с встряхиванием при 200 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние роста, объем образца и обработка будут отличаться в зависимости от интересующих липидов. Перед проведением полноценных экспериментов необходимо эмпирически определить оптимальные условия роста и объемы культуры. В этом протоколе обсуждается радиомаркировка дрожжевых культур, выращенных до стационарной ф....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе мы продемонстрировали, что маркировка, обнаружение и количественная оценка видов NL могут быть выполнены путем метаболической маркировки 14С-уксусной кислоты. Основные виды NL могут быть разделены в системе растворителей 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Гексан:Нефтяной эфир:Диэтиловый эфир:Уксусная кислота(Рисунок 1A,B). Люминофорная визуализация позволяет визуализировать меченые свободные жирные кислоты (FFA), триацилглицерин (TG), диацилглицерин (DG), холе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь представлен универсальный протокол радиомаркировки для количественного мониторинга синтеза видов NL в дрожжах. Этот протокол очень модульный, что позволяет закончить процедуру в течение 3-6 дней. Кроме того, существует множество литературы по использованию TLC для разделения липидных видов и метаболитов, что должно позволить пользователю обнаружить несколько липидных видов, представляющих интерес, с простым изменением систем растворителей TLC16,19. Этот про.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов при подготовке данной рукописи.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Хенне за помощь и концептуальные советы в завершении этого исследования. W.M.H. поддерживается фондами Фонда Уэлча (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Фонда медицинских исследований Ара Паресгиана и Программы стипендиатов Юго-Западного университета Юты. S.R была поддержана грантом программы T32 (5T32GM008297).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| [1-C14] Удельная активность натриевой соли уксусной кислоты: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 диолеол-sn-глицерин | Avanti | 800811O | |
| 200 proof абсолютный этанол | Sigma | 459836 | |
| Кислота мытые стеклянные шарики 425-600 мкм | Sigma | G8772 | |
| Янтарные луковицы для пипеток Pastuer | Fisher | 03-448-24 | |
| Сульфат аммония >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 сцинтилляционный счетчик | PerkinElmer | A481000 | |
| хлороформ (класс ВЭЖХ) | Fisher | C607SK | |
| Холестерин >99% | Sigma | C8667 | |
| Холестериллинолеат >98% | Sigma | C0289 | |
| Концентрированная серная кислота | Sigma | 339741 | |
| Corning 50мл конические пробирки, полипропилен с центристарным колпачком | Sigma | CLS430829 | |
| Декстроза, безводный сорт | Sigma | D9434 | |
| Диэтиловый эфир безводный сорт | Sigma | 296082 | |
| Сушильный шкаф | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume сцинтилляционная жидкость | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R центрифуга | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Накопительный люминофорный экран | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 тепловизор | |||
| Ледяная уксусная кислота, ACS марки | Sigma | 695092 | |
| Стекло 6мл сцинтилляционные флаконы | Sigma | M1901 | |
| Стеклянные колпачки центрифужных пробирок | Fisher | 14-595-36A | |
| Стеклянные центрифужные пробирки | Fisher | 14-595-35A | |
| Стеклянная пипетка Пастера | Fisher | 13-678-20C | |
| Гексан, безводный сорт | Sigma | 296090 | |
| L-аденин >99% | Sigma | A8626 | |
| L-аланин >98% | Sigma | A7627 | |
| L-аргинин >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-аспарагин >98% | Sigma | A0884 | |
| L-аспартат >98% | Sigma | A9256 | |
| L-цистеин >97% | Sigma | W326305 | |
| L-глутаминовая кислота моногидрат соли натрия >98% | Sigma | 49621 | |
| L-глутамин >99% | Sigma | G3126 | |
| L-глицин >99% | Sigma | G8898 | |
| L-гистидин >99% | Sigma | H8000 | |
| L-изолейцин >98% | Sigma | I2752 | |
| L-лейцин >98% | Sigma | L8000 | |
| L-лизин >98% | Sigma | L5501 | |
| L-метионин, ВЭЖХ класса | Sigma | M9625 | |
| L-фенилаланин, реагент класса | Sigma | P2126 | |
| L-пролин >99% | Sigma | P0380 | |
| L-серин >99% | Sigma | S4500 | |
| L-теронин, реагент класса | Sigma | T8625 | |
| L-триптофан >98% | Sigma | T0254 | |
| L-тирозин >98% | Sigma | T3754 | |
| L-урацил >99% | Sigma | U0750 | |
| L-валин >98% | Sigma | V0500 | |
| Метанол, ACS класс Fisher | A412 | ||
| Олеиновая кислота >99% | Sigma | O1008 | |
| -анизальдегид | Sigma | A88107 | |
| Петролейный эфир, ACS класс | Sigma | 184519 | |
| Фосфатидилхолин, дипальмитоил >99% | пипетки Sigma | P1652 | |
| Eppendorf | 2231000713 | ||
| хлорид калия, | Sigma | P3911 | |
| , сертифицированный ACS | Fisher | S318-100 | |
| сквален >98% | Sigma | S3626 | |
| янтарная кислота кристаллический/сертифицированный | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC прокладка для насыщения | Sigma | Z265225 | |
| TLC Силикагель 60G стеклянная каналчатая пластина | Fisher | NC9825743 | Без флуоресцентных индикаторов |
| Прозрачная пластиковая пленка | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Триолеин >99% | Sigma | T7140 | |
| Вихревой смеситель | Fisher | 02-215-414 | |
| Ватман экспозиционный кассетный | Sigma | WHA29175523 | |
| Дрожжевая азотная основа без сульфата аммония и аминокислот | Sigma | Y1251 |
Ссылки
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
