Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile
Summary
Qui viene presentato un protocollo per l’etichettatura metabolica del lievito con acido 14C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.
Abstract
I lipidi neutri (NL) sono una classe di biomolecole idrofobiche e senza carica che svolgono un ruolo chiave nell’omeostasi energetica e lipidica. I NT sono sintetizzati de novo dall’acetil-CoA e sono presenti principalmente negli eucarioti sotto forma di trigliceridi (TG) e esteri di sterolo (SE). Gli enzimi responsabili della sintesi dei NL sono altamente conservati da Saccharomyces cerevisiae (lievito) all’uomo, rendendo il lievito un organismo modello utile per sezionare la funzione e la regolazione degli enzimi del metabolismo NL. Mentre si sa molto su come l’acetil-CoA viene convertito in un insieme diversificato di specie NL, i meccanismi per regolare gli enzimi del metabolismo NL e come la cattiva regolazione può contribuire alle patologie cellulari, sono ancora in fase di scoperta. Numerosi metodi per l’isolamento e la caratterizzazione delle specie NL sono stati sviluppati e utilizzati nel corso di decenni di ricerca; tuttavia, non è stato discusso un protocollo quantitativo e semplice per la caratterizzazione completa delle principali specie nl. Qui viene presentato un metodo semplice e adattabile per quantificare la sintesi de novo delle principali specie di NL nel lievito. Applichiamo l’etichettatura metabolica dell’acido C-acetico 14accoppiata con la cromatografia a strato sottile per separare e quantificare una vasta gamma di NL fisiologicamente importanti. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato per studiare i tassi di reazione in vivo degli enzimi NL o la degradazione delle specie NL nel tempo.
Introduction
L’acetil-CoA è l’elemento fondamentale di diverse biomolecole, compresi i lipidi neutri (NL), che fungono da valuta biomolecolare versatile per la costruzione di membrane, la generazione di ATP e la regolazione della segnalazione cellulare1,2. La disponibilità di NL da deviare in uno qualsiasi di questi rispettivi percorsi è, in parte, regolata dal loro stoccaggio. Le goccioline lipidiche (LD), organelli citoplasmatici composti da nuclei idrofobici di trigliceridi (TG) ed esteri di sterolo (SE), sono i principali compartimenti di stoccaggio della maggior parte dei NL cellulari. Come tali, i LD sequestrano e regolano i NL, che possono essere degradati e successivamente utilizzati per processi biochimici e metabolici3,4. È noto che l’errata regolazione delle proteine associate a NL e LD è correlata con l’insorgenza di patologie tra cui la lipodistrofia e le sindromi metaboliche5,6. Per questo motivo, l’attuale ricerca LD è intensamente focalizzata su come la sintesi nl è regolata spazialmente, temporalmente e attraverso tessuti distinti di organismi multicellulari. A causa dei ruoli cellulari onnipresenti per i NL, molti enzimi responsabili della sintesi e della regolazione dei NL sono conservati in tutti gli eucarioti7. In effetti, anche alcuni procarioti memorizzano NL in LDs8. Pertanto, organismi modello geneticamente trattabili come Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono stati utili per lo studio della sintesi e della regolazione della NL.
La separazione e la quantificazione dei NL dagli estratti cellulari può essere realizzata in una miriade di modi, tra cui gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e cromatografia liquida ultra-performante-spettrometria di massa (UPLC-MS)9,10,11. Forse il metodo più semplice per separare i NL è tramite cromatografia a strato sottile (TLC), che consente la successiva quantificazione densitometrica da una curva standard12,13. Sebbene TLC fornisca solo una separazione granulare dei NL, rimane una tecnica potente perché è poco costosa e consente la rapida separazione dei NL da più campioni contemporaneamente. Due delle sfide più considerevoli che lo studio delle NL tramite TLC devono affrontare sono: 1) l’ampia gamma di abbondanze cellulari delle specie NL e dei loro intermedi e 2) la gamma di idrofilia / idrofobicità degli intermedi lipidici all’interno delle vie di sintesi NL. Di conseguenza, la quantificazione delle specie NL tramite TLC è tipicamente limitata alle specie più abbondanti; tuttavia, l’introduzione di una radiomarcatore di acido C-acetico 14può migliorare significativamente l’individuazione di intermedi a bassa abbondanza all’interno delle vie NL. L’acido acetico viene rapidamente convertito in acetil-CoA dall’acetil-CoA sintetasi ACS214, che rende l’acido 14C-acetico un substrato di radioetichettatura adatto nel lievito15. Inoltre, la separazione sia dei NL idrofobici che degli intermedi idrofili dei NL può essere ottenuta mediante TLC attraverso l’uso di sistemi a solvente multipli16. Qui, viene presentato un metodo per la separazione dei NL utilizzando l’etichettatura metabolica dell’acido C-acetico 14nel lievito. I lipidi marcati durante il periodo di impulso vengono successivamente isolati da un protocollo di isolamento lipidico totale ben consolidato17, seguito dalla separazione delle specie NL mediante TLC. Lo sviluppo di piastre TLC sia mediante autoradiografia per visualizzare i lipidi marcati, sia uno spray chimico per visualizzare i lipidi totali, consente molteplici metodi di quantificazione. Le singole bande lipidiche possono anche essere facilmente estratte dalla piastra TLC usando una lama di rasoio e il conteggio della scintillazione può essere utilizzato per quantificare la quantità di materiale radiomarcato all’interno della banda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene presentato un versatile protocollo di radioelabazione per monitorare quantitativamente la sintesi delle specie NL nel lievito. Questo protocollo è molto modulare, il che consente di terminare la procedura entro 3-6 giorni. Inoltre, esiste una vasta letteratura sull’uso di TLC per separare specie lipidiche e metaboliti, che dovrebbe consentire all’utente di rilevare diverse specie lipidiche di interesse con un semplice cambiamento dei sistemi solventi TLC16,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Henne per l’aiuto e la consulenza concettuale nel completamento di questo studio. W.M.H. è sostenuta da fondi della Welch Foundation (I-1873), del NIH NIGMS (GM119768), dell’Ara Paresghian Medical Research Fund e dell’UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R è stata supportata da una sovvenzione del programma T32 (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
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