Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.
Abstract
Los lípidos neutros (NL) son una clase de biomoléculas hidrofóbicas y sin carga que desempeñan un papel clave en la homeostasis energética y lipídica. Las NL se sintetizan de novo a partir de acetil-CoA y están presentes principalmente en eucariotas en forma de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE). Las enzimas responsables de la síntesis de NLs están altamente conservadas desde Saccharomyces cerevisiae (levadura) a los humanos, lo que hace de la levadura un organismo modelo útil para diseccionar la función y regulación de las enzimas del metabolismo NL. Si bien se sabe mucho sobre cómo el acetil-CoA se convierte en un conjunto diverso de especies de NL, todavía se están descubriendo mecanismos para regular las enzimas del metabolismo de NL y cómo la mala regulación puede contribuir a las patologías celulares. Numerosos métodos para el aislamiento y la caracterización de especies de NL se han desarrollado y utilizado durante décadas de investigación; sin embargo, no se ha discutido un protocolo cuantitativo y simple para la caracterización integral de las principales especies de NL. Aquí, se presenta un método simple y adaptable para cuantificar la síntesis de novo de las principales especies de NL en levaduras. Aplicamos 14etiquetas metabólicas de ácido C-acético junto con cromatografía de capa delgada para separar y cuantificar una amplia gama de NL fisiológicamente importantes. Además, este método se puede aplicar fácilmente para estudiar las tasas de reacción in vivo de las enzimas NL o la degradación de las especies nl a lo largo del tiempo.
Introduction
La acetil-CoA es el bloque de construcción fundamental de diversas biomoléculas, incluidos los lípidos neutros (ML), que sirven como una moneda biomolecular versátil para construir membranas, generar ATP y regular la señalización celular1,2. La disponibilidad de NLs para ser desviados a cualquiera de estas vías respectivas está, en parte, regulada por su almacenamiento. Las gotas lipídicas (LDE), orgánulos citoplasmáticos compuestos por núcleos hidrofóbicos de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE), son los principales compartimentos de almacenamiento de la mayoría de las NEL celulares. Como tal, los LDE secuestran y regulan los NLs, que pueden ser degradados y posteriormente utilizados para procesos bioquímicos y metabólicos3,4. Se sabe que la mala regulación de las proteínas asociadas a NL y LD se correlaciona con la aparición de patologías que incluyen lipodistrofia y síndromes metabólicos5,6. Debido a esto, la investigación actual de LD se centra intensamente en cómo la síntesis de NL se regula espacialmente, temporalmente y a través de distintos tejidos de organismos multicelulares. Debido a las funciones celulares ubicuas para las NLs, muchas enzimas responsables de la síntesis y regulación de las NLs se conservan a lo largo de los eucariotas7. De hecho, incluso algunos procariotas almacenan NLs en LDs8. Por lo tanto, los organismos modelo genéticamente tratables como Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido útiles para el estudio de la síntesis y regulación de NL.
La separación y cuantificación de NLs de extractos celulares se puede lograr de muchas maneras, incluyendo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas (UPLC-MS)9,10,11. Quizás el método más simple para separar las NLs es a través de la cromatografía de capa delgada (TLC), que permite la cuantificación densitométrica posterior a partir de una curva estándar12,13. Aunque TLC proporciona solo una separación de NLs de grano de curso, sigue siendo una técnica poderosa porque es económica y permite la rápida separación de NLs de varias muestras simultáneamente. Dos de los desafíos más considerables que enfrenta el estudio de las NL a través de TLC son: 1) la amplia gama de abundancias celulares de las especies de NL y sus intermedios, y 2) el rango de hidrofilicidad / hidrofobicidad de los intermedios lipídicos dentro de las vías de síntesis de NL. En consecuencia, la cuantificación de las especies nl a través de TLC se restringe típicamente a las especies más abundantes; sin embargo, la introducción de una radioetiqueta de ácido acético 14C puede mejorar significativamente la detección de intermedios de baja abundancia dentro de las vías NL. El ácido acético se convierte rápidamente en acetil-CoA por la acetil-CoA sintetasa ACS214,que hace que el ácido 14C-acético sea un sustrato de radiomarcado adecuado enlevaduras 15. Además, la separación tanto de las NLs hidrofóbicas como de los intermedios hidrófilos de las NLs puede lograrse mediante el uso de múltiples sistemas de disolventes16. Aquí, se presenta un método para la separación de NLs utilizando el etiquetado metabólico de ácido C-acético 14en levadura. Los lípidos etiquetados durante el período de pulso se aíslan posteriormente mediante un protocolo de aislamiento lipídico total bien establecido17,seguido de la separación de las especies de NL por TLC. El desarrollo de placas TLC tanto por autoradiografía para visualizar lípidos etiquetados, como por un spray químico para visualizar lípidos totales, permite múltiples métodos de cuantificación. Las bandas lipídicas individuales también se pueden extraer fácilmente de la placa TLC utilizando una cuchilla de afeitar, y el conteo de centelleo se puede usar para cuantificar la cantidad de material radiomarcado dentro de la banda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se presenta un protocolo de radioetiquetado versátil para monitorear cuantitativamente la síntesis de especies de NL en levaduras. Este protocolo es muy modular, lo que permite que el procedimiento finalice en 3-6 días. Además, existe una gran cantidad de literatura sobre el uso de TLC para separar especies lipídicas y metabolitos, lo que debería permitir al usuario detectar varias especies lipídicas de interés con un simple cambio de los sistemas de solventes TLC16,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Henne por su ayuda y asesoramiento conceptual para completar este estudio. W.M.H. cuenta con el apoyo de fondos de la Fundación Welch (I-1873), el NIH NIGMS (GM119768), el Fondo de Investigación Médica Ara Paresghian y el Programa de Becarios Dotados del Suroeste de UT. S.R ha sido apoyada por una subvención del programa T32 (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
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