Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido ¹⁴C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Resumen

Los lípidos neutros (NL) son una clase de biomoléculas hidrofóbicas y sin carga que desempeñan un papel clave en la homeostasis energética y lipídica. Las NL se sintetizan de novo a partir de acetil-CoA y están presentes principalmente en eucariotas en forma de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE). Las enzimas responsables de la síntesis de NLs están altamente conservadas desde Saccharomyces cerevisiae (levadura) a los humanos, lo que hace de la levadura un organismo modelo útil para diseccionar la función y regulación de las enzimas del metabolismo NL. Si bien se sabe mucho sobre cómo el acetil-CoA se convierte en un conjunto diverso de especies de NL, todavía se están descubriendo mecanismos para regular las enzimas del metabolismo de NL y cómo la mala regulación puede contribuir a las patologías celulares. Numerosos métodos para el aislamiento y la caracterización de especies de NL se han desarrollado y utilizado durante décadas de investigación; sin embargo, no se ha discutido un protocolo cuantitativo y simple para la caracterización integral de las principales especies de NL. Aquí, se presenta un método simple y adaptable para cuantificar la síntesis de novo de las principales especies de NL en levaduras. Aplicamos ¹⁴etiquetas metabólicas de ácido C-acético junto con cromatografía de capa delgada para separar y cuantificar una amplia gama de NL fisiológicamente importantes. Además, este método se puede aplicar fácilmente para estudiar las tasas de reacción in vivo de las enzimas NL o la degradación de las especies nl a lo largo del tiempo.

Introducción

La acetil-CoA es el bloque de construcción fundamental de diversas biomoléculas, incluidos los lípidos neutros (ML), que sirven como una moneda biomolecular versátil para construir membranas, generar ATP y regular la señalización celular^1,2. La disponibilidad de NLs para ser desviados a cualquiera de estas vías respectivas está, en parte, regulada por su almacenamiento. Las gotas lipídicas (LDE), orgánulos citoplasmáticos compuestos por núcleos hidrofóbicos de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE), son los principales compartimentos de almacenamiento de la mayoría de las NEL celulares. Como tal, los L....

Protocolo

1. Crecimiento y etiquetado de células de levadura con ácido ¹⁴C-acético

1. Inocular un cultivo de levadura recogiendo una colonia de una placa y dispensándola en 20 ml de medios sintéticos completos (SC) que contienen 2% de dextrosa (consulte el Archivo complementario para la receta de medios SC). Incubar a 30 °C durante la noche con agitación a 200 rpm.
   NOTA: La condición de crecimiento, el volumen de la muestra y el tratamiento diferirán según los lípidos de interés. Antes de ejecutar experimentos completos, las condiciones óptimas de crecimiento y los volúmenes de cultivo deben determinarse empíricamente. Este protocolo discut....

Resultados

En este protocolo, hemos demostrado que el etiquetado, la detección y la cuantificación de las especies de NL se pueden lograr mediante el etiquetado metabólico de ácido C-acético ^14. Las principales especies de NL se pueden separar en un sistema solvente de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter dietílico:Ácido acético (Figura 1A,B). Las imágenes de fósforo permiten la visualización de ácidos grasos libres (FFA), triacilglicerol (TG), diacilglicerol (.......

Discusión

Aquí, se presenta un protocolo de radioetiquetado versátil para monitorear cuantitativamente la síntesis de especies de NL en levaduras. Este protocolo es muy modular, lo que permite que el procedimiento finalice en 3-6 días. Además, existe una gran cantidad de literatura sobre el uso de TLC para separar especies lipídicas y metabolitos, lo que debería permitir al usuario detectar varias especies lipídicas de interés con un simple cambio de los sistemas de solventes TLC^16,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
[1-C14] Actividad específica de la sal sódica del ácido acético: 45-60mCi	PerkinElmer	NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoil-sn-glicerol	Avanti	800811O
Etanol absoluto de 200 pruebas	Sigma	459836
Perlas de vidrio lavadas con ácido 425-600um	Sigma	G8772
Bombillas de ámbar para pipetas Pastuer	Fisher	03-448-24
Sulfato de amonio >99%	Sigma	A4418
Beckman LS6500 contador de centelleo	PerkinElmer	A481000
Cloroformo (grado HPLC)	Fisher	C607SK
Colesterol >99%	Sigma	C8667
Colesteril-linoleato >98%	Sigma	C0289
Ácido sulfúrico concentrado	Sigma	339741
Corning 50mL tubos cónicos, polipropileno con tapón centrador	Sigma	CLS430829
Dextrosa, grado anhidro	Sigma	D9434
Éter dietílico grado anhidro	Sigma	296082
Horno de secado	Fisher	11-475-155
EcoLume líquido de centelleo	Centrífuga VWR	IC88247001
Eppendorf 5424R	Fisher	05-401-205
GE Criba de fósforo	de almacenamiento Sigma	GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 Generador de imágenes
Ácido acético glacial, grado ACS	Sigma
vidrio Viales de centelleo de 6 ml Sigma		M1901
Tapas de tubos de centrífuga de vidrio	Fisher	14-595-36A
Tubos de centrífuga de vidrio	Fisher	14-595-35A
Pipeta Pasteur de vidrio	Fisher	13-678-20C
Hexano, grado anhidro	Sigma	296090
L-Adenina >99%	Sigma	A8626
L-Alanina >98%	Sigma	A7627
L-Arginina >99%	Sigma	A1270000
L-Asparagina >98%	Sigma	A0884
L-Aspartato >98%	Sigma	A9256
L-Cisteína >97%	Sigma	W326305
Ácido L-glutámico sal monosódica monohidrato >98%	Sigma	49621
L-Glutamina >99%	Sigma	G3126
L-glicina >99%	Sigma	G8898
L-histidina >99%	Sigma	H8000
L-isoleucina >98%	Sigma	I2752
L-leucina >98%	Sigma	L8000
L-lisina >98%	Sigma	L5501
L-metionina, grado	HPLC Sigma	M9625
L-fenilalanina, grado reactivo	Sigma	P2126
L-prolina >99%	Sigma	P0380
L-serina >99%	Sigma	S4500
L-teronina, grado reactivo	Sigma	T8625
L-triptófano >98%	Sigma	T0254
L-tirosina >98%	Sigma	T3754
L-uracilo >99%	Sigma	U0750
L-valina >98%	Sigma	V0500
Metanol, grado ACS	Fisher	A412
Ácido oleico >99%	Sigma	O1008
p-anisaldehído	Sigma	A88107
Éter de petróleo, grado ACS	Sigma	184519
Fosfatidilcolina, dipalmitoil >99%	Sigma	P1652
Pipetas	Eppendorf	2231000713
Cloruro de potasio, grado ACS	Sigma	P3911
Pellets de hidróxido de sodio, certificado ACS	Fisher	S318-100
Escualeno >98%	Sigma	S3626
Ácido succínico cristalino/certificado	Fisher	110-15-6
TLC almohadilla de saturación	Sigma	Z265225
TLC gel de sílice 60G placa canalizada de vidrio	Fisher	NC9825743	Sin indicadores fluorescentes
Película plástica	de transparencia Apollo	829903
Tricine	Sigma	T0377
Trioleína >99%	Sigma	T7140
Mezclador de vórtice	Fisher	02-215-414
Casete de exposición Whatman	Sigma	WHA29175523
Base de nitrógeno de levadura sin sulfato de amonio y aminoácidos	Sigma	Y1251

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