मेटाबोलिक लेबलिंग और पतली परत क्रोमेटोग्राफी द्वारा सैकरोमाइसेस सेर्विसिया में तटस्थ लिपिड संश्लेषण का विश्लेषण
Summary
यहां, 14सी-एसिटिक एसिड के साथ खमीर के मेटाबोलिक लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जिसे बेअसर लिपिड के पृथक्करण के लिए पतली परत क्रोमेटोग्राफी के साथ मिलकर किया जाता है।
Abstract
न्यूट्रल लिपिड (एनएलएस) हाइड्रोफोबिक, चार्जलेस बायोमॉलिक्यूल्स का एक वर्ग है जो ऊर्जा और लिपिड होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एनएलएस एसिटिल-सीओए से संश्लेषित डी नोवो हैं और मुख्य रूप से ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएस) और स्टेरोल-एस्टर (एसईईएस) के रूप में यूकेरियोट्स में मौजूद हैं। एनएलएस के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार एंजाइमों को मनुष्यों के लिए सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (खमीर) से अत्यधिक संरक्षित किया जाता है, जिससे खमीर को एनएल मेटाबोलिज्म एंजाइमों के कार्य और विनियमन को विच्छेदन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल जीव बना दिया जाता है। जबकि बहुत कैसे एसीटाइल-CoA एनएल प्रजातियों के एक विविध सेट में परिवर्तित किया जाता है के बारे में जाना जाता है, एनएल चयापचय एंजाइमों को विनियमित करने के लिए तंत्र, और कैसे गलत विनियमन सेलुलर विकृतियों में योगदान कर सकते हैं, अभी भी खोजा जा रहा है । एनएल प्रजातियों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए कई तरीकों को विकसित किया गया है और दशकों के अनुसंधान में उपयोग किया गया है; हालांकि, प्रमुख एनएल प्रजातियों के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए एक मात्रात्मक और सरल प्रोटोकॉल पर चर्चा नहीं की गई है । यहां, खमीर में प्रमुख एनएल प्रजातियों के डी नोवो संश्लेषण की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और अनुकूलनीय विधि प्रस्तुत की जाती है। हम 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग को पतली परत क्रोमेटोग्राफी के साथ अलग करने और शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण एनएलएस की विविध श्रृंखला को निर्धारित करने के लिए लागू करते हैं । इसके अतिरिक्त, इस विधि को आसानी से एनएल एंजाइमों या समय के साथ एनएल प्रजातियों के क्षरण के वीवो प्रतिक्रिया दरों में अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
एसिटिल-सीओए तटस्थ लिपिड (एनएलएस) सहित विविध जैव अणुओं का मौलिक भवन ब्लॉक है, जो झिल्ली के निर्माण, एटीपी उत्पन्न करने और सेल सिग्नलिंग1,2को विनियमित करने के लिए एक बहुमुखी जैव अणु मुद्रा के रूप में काम करता है। इनमें से किसी भी संबंधित रास्ते में नृश किए जाने वाले एनएलएस की उपलब्धता उनके भंडारण द्वारा विनियमित है । लिपिड ड्रॉपलेट्स (एलडीएस), ट्राइग्लिसराइड्स (टीजीएस) और स्टेरोल-एस्टर (एसईएस) के हाइड्रोफोबिक कोर से बने साइटोप्लाज्मिक ऑर्गेनेल्स, अधिकांश सेलुलर एनएलएस के मुख्य भंडारण डिब्बे हैं। इस प्रकार, एलडी एनएलएस को अलग और विनियमित करता है, जिसे नीचा दिखाया जा सकता है और बाद में जैव रासायनिक और मेटाबोलिक प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है3,4। यह ज्ञात है कि एनएल और एलडी से जुड़े प्रोटीन का गलत नियमन लिपोडिस्ट्रोफी और मेटाबोलिक सिंड्रोम5, 6सहित विकृत विकृत है। इस वजह से, वर्तमान एलडी अनुसंधान तीव्रता से इस बात पर केंद्रित है कि एनएल संश्लेषण को कैसे विस्तृत रूप से, अस्थायी रूप से और बहु-सेलुलर जीवों के अलग-अलग ऊतकों में विनियमित किया जाता है। एनएलएस के लिए सर्वव्यापी सेलुलर भूमिकाओं के कारण, एनएलएस के संश्लेषण और विनियमन के लिए जिम्मेदार कई एंजाइम पूरे यूकेरियोट्स 7 मेंसंरक्षितहोते हैं। दरअसल, यहां तक कि कुछ प्रोकारियोट्स एलडीएस8में एनएलएस स्टोर करते हैं । इसलिए, आनुवंशिक रूप से ट्रैकेबल मॉडल जीव जैसे सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (नवोदित खमीर) एनएल संश्लेषण और विनियमन के अध्ययन के लिए उपयोगी रहे हैं।
सेल अर्क से एनएलएस के पृथक्करण और मात्राकरण को असंख्य तरीकों से पूरा किया जा सकता है, जिसमें गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस), उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी), और अल्ट्रा-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (यूपीएलसी-एमएस)9,10, 11शामिल हैं। शायद एनएलएस को अलग करने के लिए सबसे सरल तरीका पतली परत क्रोमेटोग्राफी (टीएलसी) के माध्यम से है, जो मानक वक्र12,13से बाद के घनत्व मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। हालांकि टीएलसी एनएलएस का केवल एक कोर्स-दानेदार पृथक्करण प्रदान करता है, यह एक शक्तिशाली तकनीक बनी हुई है क्योंकि यह सस्ती है, और यह एक साथ कई नमूनों से एनएलएस के तेजी से अलग होने की अनुमति देता है। टीएलसी के माध्यम से एनएलएस के अध्ययन का सामना करने वाली सबसे काफी चुनौतियों में से दो हैं: 1) एनएल प्रजातियों और उनके मध्यवर्ती के सेलुलर बहुतायत की व्यापक श्रृंखला, और 2) एनएल संश्लेषण मार्गों के भीतर लिपिड मध्यवर्ती की हाइड्रोफिलिसिटी/हाइड्रोफोबसिटी की सीमा । नतीजतन, टीएलसी के माध्यम से एनएल प्रजातियों का मात्राकरण आमतौर पर सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों तक सीमित है; हालांकि, 14सी-एसिटिक एसिड रेडियोलेबल की शुरूआत एनएल रास्तों के भीतर कम बहुतायत मध्यवर्ती का पता लगाने में काफी वृद्धि कर सकती है। एसिटिक एसिड को एसिटिल-सीओए सिंथेस्टेस एसी214द्वारा तेजी से एसिटिल-सीओए में परिवर्तित किया जाता है, जो 14सी-एसिटिक एसिड को खमीर15में उपयुक्त रेडियोलाबेलिंग सब्सट्रेट बनाता है। इसके अतिरिक्त, एनएलएस के हाइड्रोफोबिक एनएलएस और हाइड्रोफिलिक इंटरमीडिएट दोनों को अलग करने का लक्ष्य टीएलसी द्वारा मल्टीपल सॉल्वेंट सिस्टम16के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। यहां, खमीर में 14सी-एसिटिक एसिड मेटाबोलिक लेबलिंग का उपयोग करके एनएलएस के पृथक्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। नाड़ी अवधि के दौरान लेबल किए गए लिपिड को बाद में एक अच्छी तरह से स्थापित कुल लिपिड आइसोलेशन प्रोटोकॉल17द्वारा अलग किया जाता है, जिसके बाद टीएलसी द्वारा एनएल प्रजातियों को अलग किया जाता है। लेबल किए गए लिपिड की कल्पना करने के लिए दोनों ऑटोरेडियोग्राफी द्वारा टीएलसी प्लेटों का विकास, और कुल लिपिड की कल्पना करने के लिए एक रासायनिक स्प्रे, मात्राकरण के कई तरीकों के लिए परमिट। व्यक्तिगत लिपिड बैंड भी आसानी से एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर टीएलसी प्लेट से निकाला जा सकता है, और प्रस्फुटन गिनती बैंड के भीतर रेडियोलेबल सामग्री की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, खमीर में एनएल प्रजातियों के संश्लेषण की मात्रात्मक निगरानी करने के लिए एक बहुमुखी रेडियोलाबेलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल बहुत मॉड्यूलर है, जो प्रक्रिया को 3-6 दिनों के भीतर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस अध्ययन के पूरा होने में मदद और वैचारिक सलाह के लिए हेन लैब के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । डब्ल्यू.M एच को वेल्च फाउंडेशन (आई-1873), एनआईएच एनआईजीएमएस (GM119768), आरा पैरासघियन मेडिकल रिसर्च फंड और यूटी साउथवेस्टियन एंडोइन स्कॉलर्स प्रोग्राम से फंड द्वारा समर्थित किया गया है। एसआर को T32 प्रोग्राम ग्रांट (5T32GM008297) द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
