Analyse av nøytral lipidsyntese i saccharomyces cerevisiae ved metabolsk merking og tynn lagkromatografi
Summary
Her presenteres en protokoll for metabolsk merking av gjær med 14C-eddiksyre, som er kombinert med tynn lagkromatografi for separasjon av nøytrale lipider.
Abstract
Nøytrale lipider (NLs) er en klasse hydrofobe, ladløse biomolekyler som spiller nøkkelroller i energi og lipid homeostase. NLs er syntetisert de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form av triglyserider (TGs) og sterol-estere (SE). Enzymene som er ansvarlige for syntesen av NLs er sterkt bevart fra Saccharomyces cerevisiae (gjær) til mennesker, noe som gjør gjær til en nyttig modellorganisme for å dissekere funksjonen og reguleringen av NL-metabolismenzymer. Mens mye er kjent om hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldig sett med NL-arter, oppdages mekanismer for regulering av NL-metabolismeenzymer, og hvordan feilregulering kan bidra til cellulære patologier. Tallrike metoder for isolering og karakterisering av NL-arter har blitt utviklet og brukt over flere tiår med forskning; Det er imidlertid ikke diskutert en kvantitativ og enkel protokoll for omfattende karakterisering av store NL-arter. Her presenteres en enkel og tilpasningsdyktig metode for å kvantifisere de novo-syntesen av store NL-arter i gjær. Vi bruker 14C-eddiksyre metabolsk merking kombinert med tynn lagkromatografi for å skille og kvantifisere et mangfoldig utvalg av fysiologisk viktige NLs. I tillegg kan denne metoden lett brukes til å studere in vivo reaksjonshastigheter av NL enzymer eller nedbrytning av NL-arter over tid.
Introduction
Acetyl-CoA er den grunnleggende byggesteinen i forskjellige biomolekyler, inkludert nøytrale lipider (NLs), som tjener som en allsidig biomolekylær valuta for å bygge membraner, generere ATP og regulere cellesignalering1,2. Tilgjengeligheten av NLs som skal shunted inn i noen av disse respektive veiene er delvis regulert av deres lagring. Lipiddråper (LDer), cytoplasmatiske organeller sammensatt av hydrofobe kjerner av triglyserider (TG) og sterol-estere (SE), er de viktigste lagringsrommene til de fleste cellulære NLer. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan degraderes og deretter brukes til biokjemiske og metabolske prosesser3,4. Det er kjent at feilregulering av NL- og LD-assosierte proteiner er korrelert med utbruddet av patologier, inkludert lipodystrofi og metabolske syndromer5,6. På grunn av dette er nåværende LD-forskning intenst fokusert på hvordan NL-syntese reguleres romlig, timelig og på tvers av distinkte vev av multi-cellulære organismer. På grunn av allestedsnærværende cellulære roller for NLs, er mange enzymer som er ansvarlige for syntesen og reguleringen av NLs bevart gjennom eukaryoter7. Faktisk lagrer selv noen prokaryoter NLs i LDer8. Derfor har genetisk gjennomførbare modellorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gjær) vært nyttige for studiet av NL-syntese og regulering.
Separasjon og kvantifisering av NLer fra celleekstrakter kan oppnås på en rekke måter, inkludert gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS), høyytelses væskekromatografi (HPLC) og ultraytelses væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Kanskje den enkleste metoden for å skille NLer er via tynn lagkromatografi (TLC), som muliggjør etterfølgende densitometrisk kvantifisering fra en standardkurve12,13. Selv om TLC bare gir en kurskornet separasjon av NLs, forblir det en kraftig teknikk fordi den er billig, og det gir mulighet for rask separasjon av NLs fra flere prøver samtidig. To av de viktigste utfordringene studien av NLs står overfor via TLC er: 1) det brede spekteret av cellulære overflod av NL-arter og deres mellomprodukter, og 2) omfanget av hydrofilisitet/hydrofobiskhet av lipid mellomprodukter innenfor NL-synteseveier. Følgelig er kvantifiseringen av NL-arter via TLC vanligvis begrenset til de mest tallrike artene; Imidlertid kan innføring av en 14C-eddiksyreradiomerket forbedre påvisning av lave overflodsforenkninger innenfor NL-veier betydelig. Eddiksyre omdannes raskt til acetyl-CoA av acetyl-CoA-syntetase ACS214, noe som gjør 14C-eddiksyre til et egnet radiomerket substrat i gjær15. I tillegg kan separasjon av både hydrofobe NLs og hydrofile mellomprodukter av NLs oppnås ved TLC ved bruk av flere løsningsmiddelsystemer16. Her presenteres en metode for separasjon av NLs ved hjelp av 14C-eddiksyre metabolsk merking i gjær. Lipider merket i løpet av pulsperioden isoleres deretter av en veletablert total lipidisolasjonsprotokoll17, etterfulgt av separasjon av NL-arter av TLC. Utvikling av TLC-plater ved både autoradiografi for å visualisere merkede lipider, og en kjemisk spray for å visualisere totale lipider, tillater flere metoder for kvantifisering. Individuelle lipidbånd kan også enkelt ekstraheres fra TLC-platen ved hjelp av et barberblad, og scintillasjonstelling kan brukes til å kvantifisere mengden radiomerket materiale i båndet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenteres en allsidig radiomerkingsprotokoll for kvantitativ overvåking av syntesen av NL-arter i gjær. Denne protokollen er veldig modulær, noe som gjør at prosedyren kan fullføres innen 3-6 dager. I tillegg eksisterer et vell av litteratur om bruk av TLC for å skille lipidarter og metabolitter, noe som bør tillate brukeren å oppdage flere lipidarter av interesse med en enkel endring av TLC løsningsmiddelsystemer16,19. Denne protokollen bidrar til…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke medlemmene av Henne-laboratoriet for hjelp og konseptuelle råd i gjennomføringen av denne studien. W.M.H. støttes av midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R har blitt støttet av et T32-programstipend (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
