Analys av neutral lipidsyntes i Sackaromyces cerevisiae av metabolisk märkning och tunnskiktskromatografi
Summary
Här presenteras ett protokoll för metabolisk märkning av jäst med 14C-ättiksyra, som är i kombination med tunn lagerkromatografi för separation av neutrala lipider.
Abstract
Neutrala lipider (NLs) är en klass hydrofoba, laddningsfria biomolekyler som spelar nyckelroller i energi och lipidhomeostas. NLs är syntetiserade de novo från acetyl-CoA och finns främst i eukaryoter i form av triglycerider (TGs) och sterol-estrar (SEs). Enzymerna som ansvarar för syntesen av NLs är mycket bevarade från Saccharomyces cerevisiae (jäst) till människor, vilket gör jäst till en användbar modellorganism för att dissekera funktionen och regleringen av NL metabolism enzymer. Medan mycket är känt om hur acetyl-CoA omvandlas till en mångfald av NL arter, mekanismer för reglering NL metabolism enzymer, och hur felreglering kan bidra till cellulära patologier, fortfarande upptäcks. Många metoder för isolering och karakterisering av NL-arter har utvecklats och använts under årtionden av forskning. Ett kvantitativt och enkelt protokoll för omfattande karakterisering av större NL-arter har dock inte diskuterats. Här presenteras en enkel och anpassningsbar metod för att kvantifiera de novo-syntesen av större NL-arter i jäst. Vi tillämpar 14C-ättiksyra metabolisk märkning i kombination med tunn lagerkromatografi för att separera och kvantifiera ett varierat utbud av fysiologiskt viktiga NLs. Dessutom kan denna metod enkelt tillämpas för att studera in vivo reaktionshastigheter av NL enzymer eller nedbrytning av NL arter över tid.
Introduction
Acetyl-CoA är den grundläggande byggstenen i olika biomolekyler inklusive neutrala lipider (NLs), som fungerar som en mångsidig biomolekylär valuta för att bygga membran, generera ATP och reglera cellsignalering1,2. Tillgången till NLs som ska shuntas in i någon av dessa respektive vägar regleras delvis av deras lagring. Lipiddroppar (LD), cytoplasmiska organeller bestående av hydrofoba kärnor av triglycerider (TGs) och sterolestrar (SEs), är de viktigaste förvaringsfacken för de flesta cellulära NLs. Som sådan spärrar och reglerar LDs NLs, som kan försämras och därefter användas för biokemiska och metaboliska processer3,4. Det är känt att felreglering av NL och LD-associerade proteiner är korrelerad med uppkomsten av patologier inklusive lipodystrofi och metabola syndrom5,6. På grund av detta är nuvarande LD-forskning intensivt inriktad på hur NL-syntesen regleras rumsligt, tidsmässigt och över distinkta vävnader av multicellulära organismer. På grund av de allestädes närvarande cellulära rollerna för NLs, många enzymer som ansvarar för syntes och reglering av NLs bevaras i hela eukaryoter7. Faktum är att även vissa prokaryoter lagrar NLs i LDs8. Därför har genetiskt kanterbara modellorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirande jäst) varit användbara för studier av NL-syntes och reglering.
Separation och kvantifiering av NLs från cell extrakt kan åstadkommas på en mängd olika sätt, inklusive gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), högpresterande flytande kromatografi (HPLC) och ultra-prestanda flytande kromatografi-masspektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Kanske är den enklaste metoden för att separera NLs via tunn lagerkromatografi (TLC), vilket möjliggör efterföljande densitometrisk kvantifiering från enstandardkurva 12,13. Även om TLC endast ger en kurskornig separation av NLs, är det fortfarande en kraftfull teknik eftersom det är billigt, och det möjliggör snabb separation av NLs från flera prover samtidigt. Två av de viktigaste utmaningarna som studien av NLs via TLC står inför är: 1) det breda utbudet av cellulära överflöd av NL-arter och deras intermediärer, och 2) utbudet av hydrofilicitet/hydrofobi för lipid intermediärer inom NL syntesvägar. Kvantifieringen av NL-arter via TLC är därför vanligtvis begränsad till de vanligaste arterna. Införandet av en 14C-ättiksyra radiolabel kan dock avsevärt förbättra upptäckten av låg överflöd intermediärer inom NL vägar. Ättiksyra omvandlas snabbt till acetyl-coa av acetyl-CoA-syntas ACS214, vilket gör 14C-ättiksyra till ett lämpligt radiomärkningssubstrat i jäst15. Dessutom kan separation av både hydrofoba NLs och hydrofila intermediärer av NLs uppnås genom TLC genom användning av flera lösningsmedelssystem16. Här presenteras en metod för separation av NLs med 14C-ättiksyra metabolisk märkning i jäst. Lipider märkta under pulsperioden isoleras därefter av ett väletablerat totalt lipidisoleringsprotokoll17, följt av separation av NL-arter med TLC. Utveckling av TLC-plattor genom både autoradiografi för att visualisera märkta lipider och en kemisk spray för att visualisera totala lipider, tillåter flera kvantifieringsmetoder. Enskilda lipidband kan också enkelt extraheras från TLC-plattan med hjälp av ett rakblad, och scintillationsräkning kan användas för att kvantifiera mängden radiomärkt material i bandet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenteras ett mångsidigt radiomärkningsprotokoll för att kvantitativt övervaka syntesen av NL-arter i jäst. Detta protokoll är mycket modulärt, vilket gör att proceduren kan avslutas inom 3-6 dagar. Dessutom finns det en mängd litteratur om användningen av TLC för att separera lipidarter och metaboliter, vilket bör göra det möjligt för användaren att upptäcka flera lipidarter av intresse med en enkel förändring av TLC-lösningsmedelssystem16,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka medlemmarna i Henne-labbet för hjälp och konceptuell rådgivning i slutförandet av denna studie. W.M.H. stöds av medel från Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund och UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R har fått stöd av ett T32-programbidrag (5T32GM008297).
Materials
| [1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
| 18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
| 200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
| Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
| Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
| Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
| Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
| Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
| Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
| Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
| Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
| Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
| Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
| Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
| EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
| Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
| GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
| GE Typhoon FLA9500 imager | |||
| Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
| Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
| Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
| Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
| Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
| L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
| L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
| L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
| L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
| L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
| L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
| L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
| L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
| L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
| L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
| L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
| L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
| L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
| L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
| L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
| L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
| L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
| L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
| L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
| L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
| L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
| L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
| Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
| Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
| p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
| Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
| Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
| Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
| Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
| Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
| Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
| Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
| TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
| TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
| Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
| Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
| Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
| Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |
References
- Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
- Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
- Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
- Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
- Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
- Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
- Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
- Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
- Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
- Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
- Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
- Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
- Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
- Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
- Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
