Vi beskriver en hurtig og robust protokol til at berige invariant naturlige dræber T (iNKT) celler fra musen milt og udvide dem in vitro til egnede tal for in vitro og in vivo undersøgelser.
Invariante Natural Killer T (iNKT) celler er medfødte-lignende T lymfocytter udtrykker en bevaret semi-invariant T-celle receptor (TCR) specifikke for selv eller mikrobielle lipid antigener præsenteret af ikke-polymorfe MHC klasse I-relaterede molekyle CD1d. Prækliniske og kliniske undersøgelser understøtter en rolle for iNKT celler i kræft, autoimmunitet og smitsomme sygdomme. iNKT-celler er meget konserverede i hele arterne, og deres undersøgelse er blevet lettet af musemodeller, herunder CD1d-mangelfulde eller iNKT-mangelfulde mus, og muligheden for utvetydigt at opdage dem hos mus og mænd med CD1d tetramers eller mAbs, der er specifikke for den semi-invariante TCR. Men, iNKT celler er sjældne, og de skal udvides for at nå håndterbare tal for enhver undersøgelse. Fordi dannelsen af primær mus iNKT cellelinje in vitro har vist sig vanskeligt, har vi oprettet en robust protokol til at rense og udvide milt iNKT celler fra iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg), hvor iNKT celler er 30 gange hyppigere. Vi viser her, at primære milt iVα14Tg iNKT-celler kan beriges gennem en immunmagnetisk adskillelsesproces, hvilket giver omkring 95-98% rene iNKT-celler. De rensede iNKT-celler stimuleres af anti-CD3/CD28 perler plus IL-2 og IL-7, hvilket resulterer i 30 gange ekspansion af dag +14 af kulturen med 85-99% renhed. De udvidede iNKT-celler kan let genetisk manipuleres, hvilket giver et uvurderligt værktøj til at dissekere aktiverings- og funktionsmekanismer og endnu vigtigere også ved adoptivoverførsel in vivo.
Invariant Naturlige dræber T-celler (iNKT-celler) er medfødte T-lymfocytter, der udtrykker en semi-invariant αβ T-celle receptor (TCR), dannet i mus af en invariant Vα14-Jα18 kæde parret med et begrænset sæt af forskellige Vβ kæder1, som er specifik for lipid antigener præsenteret af MHC klasse I-relaterede molekyle CD1d2. iNKT-celler gennemgår et agonistisk udvælgelsesprogram, hvilket resulterer i erhvervelse af en aktiveret /medfødt effektor fænotype, der allerede er i thymusen, hvilket sker gennem flere modningsstadier3,4, der producerer en CD4+ og en CD4– delmængde. Gennem dette program, iNKT celler erhverve forskellige T hjælper (TH)effektor fænotyper, nemlig TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) og TH17 (iNKT17), identificerbare ved udtryk for transskription faktorer T-bet, GATA3, PLZF, og RORγt, henholdsvis5. iNKT-celler genkender en række mikrobielle lipider, men er også selvreaktive mod endogene lipider, der er opreguleret i forbindelse med patologiske situationer med cellestress og vævsskader, såsom kræft og autoimmunitet2. Ved aktivering modulerer iNKT-celler funktionerne i andre medfødte og adaptive immuneffektorceller via direkte kontakt og cytokinproduktion2.
Undersøgelserne af iNKT-celler er blevet lettet af musemodeller, herunder CD1d-mangelfulde eller Jα18-mangelfulde mus, og af produktionen af antigenindlæste CD1d tetramers plus dannelsen af monoklonale antistoffer (mAbs), der er specifikke for den menneskelige semi-invariant TCR. Men dannelsen af primær mus iNKT celle linje har vist sig vanskeligt. For bedre at karakterisere antitumorfunktionerne i iNKT-celler og bruge dem til adoptivcelleterapi opretter vi en protokol til at rense og udvide milt iNKT-celler af iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg)6, hvor iNKT-celler er 30 gange hyppigere end i vilde mus.
Udvidede iNKT-celler kan udnyttes til in vitro-analyser og in vivo ved overførsel tilbage til mus. I denne indstilling har vi for eksempel vist deres potente anti-tumor effekter7. Desuden er in vitro udvidede iNKT-celler modtagelige for funktionel modifikation via genoverførsel eller redigering forud for deres injektion in vivo8, hvilket giver indsigtsfuld funktionel analyse af molekylære veje samt baner vejen for avancerede celleterapier.
Her viser vi en reproducerbar og gennemførlig protokol for at få millioner af brugsklare iNKT-celler. På grund af manglen på disse celler in vivo var der meget brug for en metode til at udvide dem. Den protokol, vi foreslår, kræver hverken en bestemt instrumentering eller et stort antal mus. Vi udnyttede iVα14-Jα18 transgene mus med vilje til at reducere antallet af mus, der var nødvendige for proceduren.
En anden vellykket protokol for iNKT celle ekspansion fra iVα14-Jα18 transgene…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Paolo Dellabona og Giulia Casorati for videnskabelig støtte og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også NIH Tetramer Core Facility for mus CD1d tetramer. Undersøgelsen blev finansieret af Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (til M.F.) og Italian Association for Cancer Research (AIRC) stipendium 2019-22604 (til GDP).
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
hrIL-2 | Chiron Corp | ||
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
PFA | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |