Summary

טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

Published: February 15, 2021
doi:

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מהיר וחזק להעשרת תאי T (iNKT) של הרוצח הטבעי invariant מטחול העכבר ולהרחיב אותם במבחנה למספרים מתאימים למחקרי מבחנה ומחקרי ויוו.

Abstract

תאי T (iNKT) Invariant Natural Killer הם לימפוציטים דמויי T מולדים המבטאים קולטן תאי T חצי-אינבראנטים שמורים (TCR) הספציפי לאנטיגנים שומנים עצמיים או מיקרוביאליים המוצגים על ידי המולקולה הלא פולימורפית מסוג MHC I הקשורה למולקולה CD1d. מחקרים פרה-קליניים וקליניים תומכים בתפקיד לתאי iNKT בסרטן, אוטואימוניות ומחלות זיהומיות. תאי iNKT נשמרים מאוד בכל המינים והחקירה שלהם התאפשרה על ידי מודלים של עכברים, כולל עכברים לקויי CD1D או iNKT לקויים, ואת האפשרות לזהות אותם באופן חד משמעי בעכברים וגברים עם tetramers CD1d או mAbs ספציפי עבור TCR חצי invariant. עם זאת, תאי iNKT הם נדירים ויש להרחיב אותם כדי להגיע למספרים הניתנים לניהול עבור כל מחקר. מכיוון שהדור של קו תאי iNKT הראשי של העכבר במבחנה הוכח כקשה, הקמנו פרוטוקול חזק לטיהור והרחבת תאי iNKT טחול מהעכברים מהונדסים iVα14-Jα18 (iVα14Tg), שבו תאי iNKT שכיחים פי 30. אנו מראים כאן כי תאי iNKT iVα14Tg הטחול העיקריים יכולים להיות מועשרים באמצעות תהליך הפרדה אימונומגנטי, המניב כ 95-98% תאי iNKT טהורים. תאי iNKT המטוהרים מגורים על ידי חרוזי אנטי CD3/CD28 בתוספת IL-2 ו- IL-7, וכתוצאה מכך התרחבות פי 30 ביום +14 של התרבות עם טוהר של 85-99%. תאי iNKT המורחבים ניתנים למניפולציה גנטית בקלות, ומספקים כלי רב ערך לנתח מנגנוני הפעלה ותפקוד במבחנה, וחשוב מכך, גם עם העברה מאמצת ב- vivo.

Introduction

תאי T קטלניים טבעיים Invariant (תאי iNKT) הם לימפוציטים דמויי T מולדים המבטאים קולטן תאי T חצי אינבריאנט (TCR), שנוצר בעכברים על ידי שרשרת Vα14-Jα18 בשילוב עם קבוצה מוגבלת של שרשראות Vβ מגוונות1, אשר ספציפי עבור אנטיגנים שומנים המוצגים על ידי סוג MHC מולקולה הקשורה I CD1d2. תאי iNKT עוברים תוכנית בחירה אגוניסטית וכתוצאה מכך רכישת פנוטיפ מפעיל מופעל / מולד כבר התימוס, אשר מתרחשת דרך מספר שלביהתבגרות 3,4, הפקת CD4+ ו CD4קבוצת משנה. באמצעות תוכנית זו, תאי iNKT לרכוש פנוטיפים מחולל T מובחנים (TH),כלומר TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) ו TH17 (iNKT17), לזיהוי על ידי הביטוי של גורמי שעתוק T-bet, GATA3, PLZF, ו RORγt, בהתאמה5. תאי iNKT מזהים מגוון של שומנים מיקרוביאליים אך הם גם מגיבים בעצמם נגד שומנים אנדוגניים כי הם upregulated בהקשר של מצבים פתולוגיים של מתח התא ונזק לרקמות, כגון סרטן ו autoimunity2. עם ההפעלה, תאי iNKT לווסת את הפונקציות של תאים אחרים מחוללי מערכת החיסון המולדת והסתגלותית באמצעות מגע ישיר וייצור ציטוקינים2.

החקירות של תאי iNKT כבר הקלו על ידי דגמי עכבר, כולל CD1d-לקוי או עכברים Jα18-לקוי, ועל ידי ייצור של tetramers CD1D טעון אנטיגן בתוספת הדור של נוגדנים חד שבטיים (mAbs) ספציפי עבור TCR חצי invariant האנושי. עם זאת, הדור של קו תא iNKT עכבר ראשי הוכיח קשה. כדי לאפיין טוב יותר את פונקציות האנטיטומור של תאי iNKT ולהשתמש בהם לטיפול תאי מאמץ, הקמנו פרוטוקול לטיהור והרחבת תאי iNKT טחול של iVα14-Jα18 עכברים מהונדסים (iVα14Tg)6, שבו תאי iNKT שכיחים פי 30 מאשר בעכברים מסוג בר.

תאי iNKT מורחבים ניתנים לניצול לבדיקות במבחנה, וב-vivo עם המעבר חזרה לעכברים. בהגדרה זו, למשל, הראינו את ההשפעות החזקות שלהם נגד הגידול7. יתר על כן, אין ויטרו מורחב iNKT תאים נוחים לשינוי פונקציונלי באמצעות העברתגניםאו עריכה לפני הזרקתם ב vivo 8 , המאפשר ניתוח פונקציונלי תובנה של מסלולים מולקולריים, כמו גם לסלול את הדרך לטיפולים תאים מתקדמים.

Protocol

הנהלים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) (מס ‘1048) במכון המדעי סן רפאלה. הערה: כל ההליכים חייבים להתבצע בתנאים סטריליים. כל הריאגנטים המשמשים מפורטים בטבלת החומרים. 1. עיבוד טחול המתת חסד iVα14-Jα18 עכברים ע?…

Representative Results

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר להעשיר תאי iNKT מהטחול של עכברים מהונדסים iVa14-Ja18 באמצעות תהליך הפרדה אימונומגנטי המסוכם באיור 1A. תאי T הטחול הכולל נבחרים לראשונה באופן שלילי על ידי דלדול תאי B ומונוציטים, ואחריו מיון אימונומגנטי חיובי של תאי iNKT עם Tetramers CD1d טעון של אנטיגן אנט?…

Discussion

כאן אנו מראים פרוטוקול לשחזור וישים כדי להשיג מיליוני תאי iNKT מוכנים לשימוש. בשל המחסור של תאים אלה ב vivo, שיטה להרחיב אותם היה נחוץ מאוד. הפרוטוקול שאנו מציעים אינו דורש מכשור מסוים ולא מספר גבוה של עכברים. ניצלנו עכברים מהונדסים iVα14-Jα18 בכוונה כדי להפחית את מספר העכברים הדרושים להליך.

<p clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לפאולו דלבונה וג’וליה קאסורטי על התמיכה המדעית והקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למתקן הליבה של NIH Tetramer עבור טטרמר CD1d עכבר. המחקר מומן על ידי פונדזיון קריפלו גרנט 2018-0366 (ל- M.F.) והאגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC) 2019-22604 (ל- G.D.).

Materials

Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution in house 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
anti-FITC Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-701
anti-PE Microbeads Miltenyi Biotec 130-048-801
Brefeldin A Sigma B6542
CD19 -FITC Biolegend 115506 clone 6D5
CD1d-tetramer -PE NIH tetramer core facility mouse PBS57-Cd1d-tetramers
CD4 -PeCy7 Biolegend 100528 clone RM4-5
Fc blocker BD Bioscience 553142
Fetal Bovine Serum (FBS) Euroclone ECS0186L heat-inactivated and filtered .22 before use
FOXP3 Transcription factor staining buffer eBioscience 00-5523-00
H2 (IAb) -FITC Biolegend 114406 clone AF6-120.1
hrIL-2 Chiron Corp
Ionomycin Sigma I0634
LD Columns Miltenyi Biotec 130-042-901
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS buffer (MB) in house 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA
MS Columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Non-essential amino acids Gibco 11140-035
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) Lonza 15140-122
PermWash BD Bioscience 51-2091KZ
PFA Sigma P6148
Phosphate buffered saline (PBS) EuroClone ECB4004L
PMA Sigma P1585
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Recombinat Mouse IL-7 R&D System 407-ML-025
RPMI 1640 with glutamax Gibco 61870-010
sodium pyruvate Gibco 11360-039
TCRβ -APC Biolegend 109212 clone H57-597
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads Gibco 11452D
β-mercaptoethanol Gibco 31350010

References

  1. Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
  2. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  3. Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
  4. Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
  5. Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
  6. Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
  7. Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
  8. Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
  9. Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
  10. Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
  11. Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
  12. de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
  13. Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
  14. Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
  15. Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
  16. Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
  17. Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
  18. Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
  19. Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
  20. Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
  21. Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
  22. Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
  23. Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
  24. Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).

Play Video

Cite This Article
Delfanti, G., Perini, A., Zappa, E., Fedeli, M. Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies. J. Vis. Exp. (168), e62214, doi:10.3791/62214 (2021).

View Video