체외 및 생체 내 연구를 위한 마우스 불변 천연 킬러 T 세포의 정화 및 확장
Summary
우리는 마우스 비장에서 불변 자연 킬러 T (iNKT) 세포를 풍부하게하고 체외 및 생체 내 연구에 적합한 숫자로 시험관 내에서 확장하기 위해 신속하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
불변성 천연 킬러 T(iNKT) 세포는 비다형성 MHC 급 I 관련 분자 CD1d.전임상 및 임상 연구에서 암, 자가면역 및 감염성 질환에서 iNKT 세포에 대한 역할을 지원하는 자체 또는 미생물 지질 항원에 특이적인 반불변성 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체이다. iNKT 세포는 종 전체에 걸쳐 매우 보존되고 그들의 조사는 CD1d 결핍 또는 iNKT 결핍 마우스를 포함하여 마우스 모델에 의해 촉진되고, 반 불변 TCR에 특이적인 CD1d 테트라머 또는 mAbs를 가진 마우스와 남자에서 명백하게 검출할 가능성. 그러나 iNKT 세포는 드물며 모든 연구를 위해 관리 가능한 숫자에 도달하기 위해 확장되어야 합니다. 시험관 내의 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성이 어렵다는 것이 입증되어 왔으니, iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)로부터 비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하기 위한 견고한 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 30배 더 빈번하다. 우리는 여기에서 1 차적인 비장 iVα14Tg iNKT 세포가 면역자기 분리 과정을 통해 풍부해질 수 있다는 것을, 대략 95-98% 순수한 iNKT 세포를 산출한다는 것을 여기에서 보여줍니다. 정제된 iNKT 세포는 안티 CD3/CD28 구슬플러스 IL-2 및 IL-7에 의해 자극되며, 85-99%의 순도로 배양의 날 +14까지 30배 확장됩니다. 확장된 iNKT 세포는 쉽게 유전적으로 조작될 수 있으며, 생체 외에서 활성화 및 기능 메커니즘을 해부하고, 더 중요한 것은 생체 내에서의 입양 전달시에도 귀중한 도구를 제공합니다.
Introduction
불변성 천연 킬러 T 세포(iNKT 세포)는 반불변성 αβ T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 선천성 T 림프구체로, 비정체 Vα14-Jα18 사슬에 의해 마우스에서 형성된 다양한 Vβ 사슬1의한정된 세트와 결합되어 MHC 급 I-관련 분자CD1 CD에의해 제시된 지질 항원특이이다. iNKT 세포는 여러 성숙 단계3,4를통해 발생하는 흉선에서 이미 활성화 / 타고난 이펙터 표현형을 획득하는 결과 고뇌선별 프로그램을 거치며 CD4+ 및 CD4– 하위 세트를 생성합니다. 이 프로그램을 통해 iNKT 세포는 T-bet, GATA3, PLZF 및 RORγt의 발현에 의해 식별 가능한T-H(iNKT1),TH2(iNKT2) 및 TH17(iNKT17)과 같은 T 조머(TH)이펙터 표현형을 획득한다. iNKT 세포는 다양한 미생물 지질을 인식하지만 암 및 자가 면역2와같은 세포 스트레스 및 조직 손상의 병리학적 상황의 맥락에서 조절되는 내인성 지질에 대해 자가 반응성이다. 활성화시, iNKT 세포는 직접 접촉 및 사이토카인 생성2를통해 다른 선천적이고 적응형 면역 이펙터 세포의 기능을 조절한다.
iNKT 세포의 조사는 CD1d-결핍 또는 Jα18-결핍 마우스를 포함하는 마우스 모델, 및 항원적 로드 CD1d 테트라머의 생산에 의해 촉진되었으며, 인간 반투명 TCR에 특이적인 단일 클론 항체(mAbs)의 생성에 의해 촉진되었다. 그러나, 1차 마우스 iNKT 세포주의 생성은 어렵다는 것을 입증했습니다. iNKT 세포의 항종양 기능을 보다 잘 특성화하고 입양 세포 치료에 활용하기 위해 iVα14-Jα18 트랜스제닉 마우스(iVα14Tg)6의비장 iNKT 세포를 정화하고 확장하는 프로토콜을 설정하여 iNKT 세포가 야생형 마우스보다 30배 더 빈번합니다.
확장된 iNKT 세포는 시험관 내 분석, 그리고 생쥐로 다시 옮겨질 때 생체 내에서 악용될 수 있다. 이 설정에서, 예를 들어, 우리는 그들의 강력한 항 종양 효과 보여 주었다7. 더욱이, 시험관 내 확장된 iNKT 세포는 생체 내에서 그들의 주입 전에 유전자 전달 또는 편집을 통해 기능적 변형을 가능하게하며,분자 통로의 통찰력 있는 기능적 분석을 허용하고, 또한 진보된 세포 치료를 위한 길을 포장할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 수백만 개의 즉시 사용할 수 있는 iNKT 셀을 얻기 위해 재현 가능하고 실행 가능한 프로토콜을 보여줍니다. 생체 내에서 이러한 세포의 빈약성으로 인해 이를 확장하는 방법이 매우 필요했습니다. 우리가 제안하는 프로토콜은 특정 계측이나 많은 수의 마우스를 필요로하지 않습니다. 당사는 절차에 필요한 마우스의 수를 줄이기 위해 iVα14-Jα18 형질전환 마우스를 의도적으로 이용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 파올로 델라보나와 줄리아 카소라티에게 과학적 지원과 원고의 비판적 독서에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 CD1d 테트라머에 대한 NIH 테트라머 코어 시설에 감사드립니다. 이 연구는 폰다지오네 카리플로 그랜트 2018-0366 (M.F.) 및 이탈리아 암 연구 협회 (AIRC) 펠로우십 2019-22604 (G.D.에)에 의해 투자되었습니다.
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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