インビトロおよびインビボ研究のためのマウス不変性ナチュラルキラーT細胞の精製と拡大
Summary
我々は、マウス脾臓から不変ナチュラルキラーT(iNKT)細胞を濃縮し、インビトロおよびインビボ研究に適した数にそれらを拡大するための迅速かつ堅牢なプロトコルを記述する。
Abstract
不変ナチュラルキラーT(iNKT)細胞は、非多形性MHCクラスI関連分子CD1dによって提示される自己または微生物脂質抗原に特異的な保存された半不変T細胞受容体(TCR)を発現する先天性Tリンパ球である。iNKT細胞は種全体を通して非常に保存されており、CD1d欠乏またはiNKT欠損マウスを含むマウスモデルによって調査が容易に行われ、半変量TCRに特異的なCD1d四量体またはmAbsを有するマウスおよび男性で明確に検出する可能性がある。しかし、iNKT細胞はまれであり、研究のために管理可能な数に達するように拡張する必要があります。インビトロでの一次マウスiNKT細胞株の生成が困難であることが証明されているため、iNKT細胞が30倍の頻度で頻繁に行われるiVα14-Jα18トランスジェニックマウス(iVα14Tg)から脾臓iNKT細胞を精製および拡張するための堅牢なプロトコルを設定しました。ここでは、一次脾臓iVα14Tg iNKT細胞は、免疫磁気分離プロセスを通じて濃縮され、約95〜98%の純粋なiNKT細胞を生み出すことができることを示しています。精製されたiNKT細胞は、抗CD3/CD28ビーズとIL-2およびIL-7によって刺激され、85〜99%の純度で培養の14日目までに30倍の膨張を生じる。拡大されたiNKT細胞は、簡単に遺伝的に操作することができ、インビトロで活性化および機能のメカニズムを解剖し、さらに重要なことに、生体内での導入転送時にも貴重なツールを提供する。
Introduction
不変ナチュラルキラーT細胞(iNKT細胞)は、半不変量αβT細胞受容体(TCR)を発現する先天性Tリンパ球であり、不変Vα14-Jα18鎖と多様なVβ鎖1の限定的なセットを組み合わせてマウスで形成される、MHCクラスI関連CD1d2によって提示される脂質抗原に特異的である。iNKT細胞は、いくつかの成熟段階3、4を経て起こる胸腺に既に活性化/先天性エフェクター表現型を獲得するアゴニスト選択プログラムを受け、CD4+およびCD4-サブセットを産生する。このプログラムを通じて、iNKT細胞は、それぞれT-ベット、GATA3、PLZF、およびRORγtの発現によって識別可能な、異なるTヘルパー(TH)エフェクター表現型、すなわちTH1(iNKT1)、TH2(iNKT2)およびTH17(iNKT17)を取得する。iNKT細胞は微生物脂質の範囲を認識するが、癌や自己免疫などの細胞ストレスや組織損傷の病的状況の状況においてアップレギュレートされる内因性脂質に対しても自己反応性である2。活性化すると、iNKT細胞は、直接接触およびサイトカイン産生2を介して他の先天性および適応免疫エフェクター細胞の機能を調節する。
iNKT細胞の研究は、CD1d欠損マウスやJα18欠損マウスを含むマウスモデル、および抗原搭載CD1d四量体の産生に加えて、ヒト半不変TCRに特異的なモノクローナル抗体(mAbs)の生成によって促進されている。しかし、一次マウスiNKT細胞株の生成は困難であることが判明した。iNKT細胞の抗腫瘍機能をより良く特徴付け、養子細胞療法に利用するために、iNKT細胞が野生型マウスの30倍の頻度でiNKT細胞を形成するiVα14-Jα18トランスジェニックマウス(iVα14Tg)6の脾臓iNKT細胞を精製・拡大するプロトコルを設定しました。
拡大したiNKT細胞は、インビトロアッセイに利用され、マウスに戻ると生体内で利用できます。この設定では、例えば、我々は、7の強力な抗腫瘍効果を示している。さらに、インビトロでのiNKT細胞は、インビボ8での注射前に遺伝子導入や編集を介した機能修飾に適しており、分子経路の洞察に富んだ機能解析を可能にし、高度な細胞療法への道を開きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、何百万ものすぐに使用できるiNKT細胞を得るための再現性と実現可能なプロトコルを示します。生体内ではこれらの細胞の貧弱性のために、それらを拡張する方法が非常に必要とされました。我々が提案するプロトコルは、特定の計装も多数のマウスも必要としない。iVα14-Jα18トランスジェニックマウスを意図的に利用し、処置に必要なマウスの数を減らした。
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
パオロ・デラボーナとジュリア・カソラティの科学的支援と原稿の批判的な読書に感謝します。また、マウスCD1dテトラマー用のNIHテトラマーコアファシリティに感謝します。この研究は、フォンダツィオーネ・カリプロ・グラント2018-0366(M.F.)とイタリアがん研究協会(AIRC)フェローシップ2019-22604(G.D.)によって資金提供されました。
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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