Нейтронная спиновая эхо-спектроскопия как уникальный зонд для динамики липидных мембран и мембранно-белковых взаимодействий

Summary

В данной статье описываются протоколы подготовки образцов, восстановления данных и анализа данных в исследованиях нейтронного спинового эха (NSE) липидных мембран. Разумное дейтериевое маркировка липидов обеспечивает доступ к различной динамике мембран на мезоскопических масштабах длины и времени, в которых происходят жизненно важные биологические процессы.

Abstract

Липидные бислои образуют основную матрицу клеточных мембран и являются основной платформой для обмена питательных веществ, белково-мембранных взаимодействий и вирусного бутонизации, среди других жизненно важных клеточных процессов. Для эффективной биологической активности клеточные мембраны должны быть достаточно жесткими, чтобы поддерживать целостность клетки и ее компартментов, но достаточно текучими, чтобы позволить мембранным компонентам, таким как белки и функциональные домены, диффундировать и взаимодействовать. Этот тонкий баланс свойств упругих и жидких мембран и их влияние на биологическую функцию требуют лучшего понимания динамики коллективной мембраны по мезоскопической длине и временным масштабам ключевых биологических процессов, например, деформаций мембраны и событий связывания белка. Среди методов, которые могут эффективно исследовать этот динамический диапазон, является спектроскопия нейтронного спинового эха (NSE). В сочетании с дейтериевой маркировкой NSE может использоваться для непосредственного доступа к колебаниям изгиба и толщины, а также к мезоскопической динамике отдельных особенностей мембраны. В данной статье приводится краткое описание методики NSE и описываются процедуры проведения экспериментов NSE на липосомальных мембранах, включая детали схем пробоподготовки и дейтерации, а также инструкции по сбору и сокращению данных. В статье также представлены методы анализа данных, используемые для извлечения ключевых параметров мембраны, таких как модуль жесткости изгиба, модуль сжимаемости площади и вязкость в плоскости. Чтобы проиллюстрировать биологическую значимость исследований NSE, обсуждаются отдельные примеры мембранных явлений, исследуемых NSE, а именно: влияние добавок на жесткость изгиба мембраны, влияние образования доменов на флуктуации мембраны и динамическую сигнатуру мембранно-белковых взаимодействий.

Introduction

Понимание клеточных мембран и их функций замечательно изменилось за последние несколько десятилетий. Прежний взгляд на клеточные мембраны как на пассивные липидные бислои, которые определяют границы клеток и белки домашней мембраны^1, постепенно трансформировался в динамическую модель, в которой липидные бислои играют важную роль в регулировании жизненно важных биологических процессов, включая клеточную сигнализацию, молекулярный обмен и функцию белка — и это^2,3,4,5,6. Это осознание того, что клеточные мембраны очень динамичны, постоянно подвергаются ремоделированию и молекулярному перераспределению, побудило к научным исследованиям за пределами равновесных структур мембран^7,8,9. Соответственно, было разработано несколько подходов к изучению различных динамических режимов в биологических и биоинспирируемых липидных мембранах. На сегодняшний день большинство этих исследований в основном сосредоточено на диффузных молекулярных движениях^10,11,12,13 и макроскопических флуктуациях формы^14,15,16,оставляя значительный пробел в понимании динамики промежуточных мембран, т. е. коллективных флуктуаций липидных сборок, состоящих из нескольких 10-100 молекул липидов. Эта динамика происходит на масштабах длины от нескольких десятков до нескольких 100 Å и во временных масштабах от суб-ns до нескольких сотен ns (см. Рисунок 1),называемых здесь мезоскопическими масштабами. Именно в этих масштабах происходит ключевая биологическая активность на мембранном уровне^17. Это включает вирусное почкование^18,канал¹⁹и мембранно-белковые взаимодействия^20. Важно также отметить, что энергетический ландшафт мембранных белков^{21, 22показывает,} что конформационные изменения в белках, необходимые для их регуляторной роли, происходят на временных масштабах^{ns 23} коллективных флуктуаций мембран, что дополнительно подчеркивает важность мезоскопической динамики в биологической функции клеточных мембран и их биоинспирируемых аналогов^20. В данной работе основное внимание уделяется двум основным мезоскопическим динамическим режимам в липидных мембранах, а именно флуктуациям изгиба и колебаниям толщины.

Основной проблемой при непосредственном провожде этих флуктуацийных режимов является сложность одновременного доступа к их пространственным и временным масштабам с использованием стандартных методов спектроскопии. Другая проблема заключается в том, что методы прямого контакта могут влиять на те же колебания, которые они предназначены для измерения^16. Это еще более усугубляется композиционной и структурной сложностью биологических мембран^24,25,что приводит к неоднородным особенностям мембраны, включая образование липидных доменов^{26,27, 28,29, 30}и асимметрию мембран^{31, 32, 33,}требуя селективных зондов для понимания динамики различных особенностей мембраны. К счастью, эти проблемы могут быть преодолены с помощью неинвазивных методов нейтронной спектроскопии, таких как нейтронное спиновое эхо (NSE), которые по своей сути получают доступ к требуемой длине и временным масштабам, а также позволяют дополнительно проводить исследования селективных особенностей мембран без изменения их физико-химической среды^34. Действительно, за последние несколько лет спектроскопия NSE превратилась в уникальный и мощный зонд коллективной мембранной динамики^35. Результаты исследований NSE на липидных мембранах дали новое представление о механических^{свойствах 36,37} и вязкоупругих^38,39 липидных мембран и пролили новый свет на их потенциальную роль в биологической функции^40,41.

Метод спектроскопии NSE основан на конструкции интерферометрического прибора, впервые предложенной Mezei^42,с использованием серии спин-ласт и магнитных катушек для управления прецессией спина нейтрона, когда нейтроны пересекают инструмент. Конструкция опирается на магнитное зеркальное отражение элементов магнитного поля относительно положения образца(рисунок 1А). Это означает, что при отсутствии обмена энергией между нейтроном и образцом нейтрон выполняет одинаковое количество спиновых прецессий в противоположных направлениях в первой и второй половине инструмента (обратите внимание на π-флиппер между двумя катушками прецессии). В результате конечное спиновое состояние нейтрона остается неизменным относительно начального состояния – явление, называемое спин-эхо (см. прозрачный нейтрон на рисунке 1А). Однако, когда нейтрон энергетически взаимодействует с образцом, энергообмен изменяет число спиновых прецессий во второй половине инструмента, что приводит к другому конечному спиновому состоянию (см. Рисунок 1А). Это экспериментально обнаруживается как потеря поляризации, как будет показано далее в этой статье. Для получения более подробной информации о технике NSE читатель обращается к специальным техническим документам^42,43,44,45.

Здесь представлено упрощенное описание, чтобы дать приблизительную оценку длины и временных масштабов, доступных с NSE. Масштабы длин определяются диапазоном достижимых волновекторных передач, Q = 4π sin θ/λ, где 2θ — угол рассеяния, а λ — длина волны нейтрона. Видно, что Q задается диапазоном длин волн и степенью вращения второго плеча спектрометра (см. рисунок 1А). Типичный Q-диапазонна спектрометрах NSE составляет ~0,02-2 Å^-146,47и до 0,01-4 Å^-1 с недавними обновлениями^48,49,что соответствует пространственным масштабам ~1-600 Å. С другой стороны, доступная шкала времени вычисляется из общего угла прецессии (или фазы), приобретенного нейтроном в магнитных катушках прецессии, и обнаруживается, что она составляет⁵⁰: . В этом выражении t — время Фурье, определяемое как , где — нейтронное гиромагнитное отношение, — длина катушки и — сила магнитного поля катушки. Стоит отметить, что время Фурье — это величина, которая строго зависит от геометрии прибора, силы магнитного поля и длины волны нейтрона. Например, используя нейтроны длины волны = 8 Å и настройки прибора   = 1,2 м и = 0,4 Тл, время Фурье вычисляется как t ~ 50 нс. Экспериментально время Фурье настраивается путем изменения тока в катушках прецессии (т. Е. Напряженность магнитного поля) или с использованием различных длин волн нейтронов, что приводит к типичным шкалам времени NSE от ~ 1 пс до 100 нс. Тем не менее, недавние обновления спектрометров NSE позволили получить доступ к более длинным временам Фурье, до ~ 400 нс на спектрометре J-NSE-Phoenix в Центре Хайнца Майера-Лейбница⁵¹ и спектрометре SNS-NSE в Национальной лаборатории Оук-Ридж⁴⁸и до ~ 1000 нс на спектрометре IN15 NSE в Институте Лауэ-Ланжевена (ILL)^49. 

Помимо прямого доступа к длине и временной шкале мембранной динамики, NSE обладает присущими 52 возможностями чувствительности к изотопам нейтронов^52. В частности, способность нейтронов по-разному взаимодействовать с изотопами водорода, наиболее распространенного элемента в биологических системах, приводит к различной плотности рассеяния нейтронов,³⁴ или NSLD (эквивалент оптического показателя преломления^50),когда протий замещается дейтерием. Это позволяет использовать подход, известный как вариация контраста, который обычно используется для выделения конкретных особенностей мембраны или сокрытия других — последний сценарий называется контрастным соответствием. Частым применением изменения/согласования контраста является замена воды (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2)тяжелой водой или D₂O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2)для усиления нейтронного сигнала от протиированных липидных мембран (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Этот подход очень эффективен в исследованиях структуры мембраны, поскольку проникновение_D2O в область головной группы мембраны позволяет точно определить толщину мембраны (см. Рисунок 2A,левая панель) и расположение различных липидных подгрупп при применении более сложных моделей^53,54. В данной работе приводятся некоторые примеры использования вариации контраста для изучения коллективной динамики в биомиметических мембранах и отдельных особенностей мембран.

Здесь эффективность NSE в предоставлении уникального понимания динамических и функциональных свойств мембран иллюстрируется наглядными примерами исследований NSE на модельных и биологически значимых липидных мембранных системах с акцентом на мезомасштабную динамику в отдельно стоящих мембранах в виде липосомальных суспензий. Для NSE измерений динамики плоских мембран читатель обращается к специализированным публикациям по нейтронно-эхо-спектроскопии (GINSES)^{55, 56} и другим исследованиям выровненных многоламелярных мембранных стеков^57,58,59,60.

Для простоты в данной работе выделены три различные схемы мембранной дейтрации, проиллюстрированные на хорошо изученной доменно-формирующей, или фазоразделяющей, липидной бислойной системе из смесей 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC)^61,62. Эти два липида характеризуются несоответствием длины углеводородной цепи (14 атомов углерода на хвост в DMPC против 18 атомов углерода на хвост в DSPC) и температуры перехода гель-жидкость (T_{m, DMPC} = 23 °C против T_{m, DSPC} = 55 °C). Это приводит к боковому фазовой разделению в мембранах DMPC:DSPC при температурах между верхними и нижними температурами перехода смеси^63. Рассмотренные здесь схемы дейтерации выбраны для демонстрации различных динамических режимов, доступных в измерениях NSE на липосомальных мембранах, а именно флуктуаций изгиба, колебаний толщины и селективных флуктуаций изгиба/толщины боковых доменов. Все липидные композиции представлены для двухслоев DMPC:DSPC, приготовленных при моль фракции 70:30, с использованием коммерчески доступных протиированных и пердевтерированных вариантов DMPC и DSPC. Все этапы подготовки образца основаны на 4 мл липосомальной суспензии в_D2Oс концентрацией липидов 50 мг/мл для общей липидной массы M_tot = 200 мг на образец.

Protocol

1. Схема деитерации, необходимая для эксперимента Для измерения флуктуаций изгиба делают полностью протиатированные липосомы вD2O(D 99,9%) илиD2O-буфере (например, фосфатный буфер, приготовленный сD2O вместоH2O). Используйте полностью протиированный DMPC (C36H7…

Representative Results

Исследования NSE, обращающиеся к флуктуациям изгиба, обычно выполняются в Q-диапазоне ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Этот Q-диапазон соответствует шкалам промежуточной длины между толщиной мембраны и липосомальным радиусом, где доминирует динамика изгиба. Измерение в расширенном Q-диапазоне может да…

Discussion

NSE является мощным и уникальным методом измерения мезоскопической динамики липидных мембран в различных условиях. Эффективное использование NSE зависит от качества образца, контраста нейтронов и диапазона доступной динамики, которая может быть исследована для данного образца. Таким о?…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples