Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Teshani Kumarage; Julie Nguyen; Rana Ashkar

doi:10.3791/62396

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Biology

Neutronenspin-Echospektroskopie als einzigartige Sonde für Lipidmembrandynamik und Membran-Protein-Wechselwirkungen

Published: May 27, 2021

doi:

10.3791/62396

Teshani Kumarage², Julie Nguyen, Rana Ashkar²

¹Department of Physics,Virginia Tech, ²Center for Soft Matter and Biological Physics,Virginia Tech

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Protokolle für die Probenvorbereitung, Datenreduktion und Datenanalyse in Neutronenspinechostudien (NSE) von Lipidmembranen. Eine umsichtige Deuteriummarkierung von Lipiden ermöglicht den Zugang zu unterschiedlichen Membrandynamiken auf mesoskopischen Längen- und Zeitskalen, über die lebenswichtige biologische Prozesse ablaufen.

Abstract

Lipiddoppelschichten bilden die Hauptmatrix der Zellmembranen und sind die primäre Plattform für Nährstoffaustausch, Protein-Membran-Interaktionen und virale Knospung, neben anderen lebenswichtigen zellulären Prozessen. Für eine effiziente biologische Aktivität sollten Zellmembranen starr genug sein, um die Integrität der Zelle und ihrer Kompartimente aufrechtzuerhalten, aber flüssig genug, um Membrankomponenten wie Proteine und funktionelle Domänen zu zerstreuen und interagieren zu lassen. Dieses empfindliche Gleichgewicht zwischen elastischen und flüssigen Membraneigenschaften und deren Einfluss auf die biologische Funktion erfordern ein besseres Verständnis der kollektiven Membrandynamik über mesoskopische Längen- und Zeitskalen wichtiger biologischer Prozesse, z. B. Membranverformungen und Proteinbindungsereignisse. Zu den Techniken, die diesen Dynamikbereich effektiv untersuchen können, gehört die Neutronenspinechospektroskopie (NSE). In Kombination mit der Deuterium-Markierung kann NSE verwendet werden, um direkt auf Biege- und Dickenschwankungen sowie auf die mesoskopische Dynamik ausgewählter Membranmerkmale zuzugreifen. Dieses Papier bietet eine kurze Beschreibung der NSE-Technik und beschreibt die Verfahren zur Durchführung von NSE-Experimenten an liposomalen Membranen, einschließlich Details zur Probenvorbereitung und Deuteration von Schemata sowie Anweisungen zur Datenerhebung und -reduktion. Das Papier stellt auch Datenanalysemethoden vor, die verwendet werden, um wichtige Membranparameter wie den Biegesteifigkeitsmodul, den Flächenkompressibilitätsmodul und die Viskosität in der Ebene zu extrahieren. Um die biologische Bedeutung von NSE-Studien zu veranschaulichen, werden ausgewählte Beispiele für Membranphänomene diskutiert, die von NSE untersucht wurden, nämlich die Wirkung von Additiven auf die Membranbiegesteifigkeit, den Einfluss der Domänenbildung auf Membranfluktuationen und die dynamische Signatur von Membran-Protein-Interaktionen.

Introduction

Das Verständnis von Zellmembranen und ihrer Funktion hat sich in den letzten Jahrzehnten bemerkenswert weiterentwickelt. Die frühere Sichtweise von Zellmembranen als passive Lipiddoppelschichten, die Zellgrenzen definieren und Membranproteine¹ beherbergen, hat sich allmählich in ein dynamisches Modell verwandelt, in dem Lipiddoppelschichten eine wichtige Rolle bei der Regulierung lebenswichtiger biologischer Prozesse spielen, einschließlich zellulärer Signalgebung, molekularer Austausch und Proteinfunktion – um nur einige zu nennen²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Diese Erkenntnis, dass Zellmembranen hochdynamisch sind und ständig umgestaltet und molekular umverteilt werden, hat wissenschaftliche Erkundungen jenseits der Gleichgewichtsstrukturen der Membranen⁷^,⁸^,⁹vorgeben. Dementsprechend wurden mehrere Ansätze entwickelt, um die verschiedenen dynamischen Modi in biologischen und bioinspirierten Lipidmembranen zu untersuchen. Bisher konzentrierte sich die Mehrheit dieser Studien hauptsächlich auf diffusive molekulare Bewegungen^{10 , 11}^,¹²^,¹³ und makroskopische Formfluktuationen¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, die eine signifikante Lücke im Verständnis der mittleren Membrandynamik hinterlassen, d.h. kollektive Fluktuationen von Lipidanordnungen, die aus wenigen 10-100s Lipidmolekülen bestehen. Diese Dynamik tritt über Längenskalen von wenigen zehn bis wenigen 100 Å und über Zeitskalen von Sub-ns bis zu einigen hundert ns auf (siehe Abbildung 1),hier als mesoskopische Skalen bezeichnet. Auf diesen Skalen findet die biologische Schlüsselaktivität auf der^{Membranebene 17}statt. Dazu gehören virale Knospen¹⁸, Kanal-Gating¹⁹und Membran-Protein-Interaktionen²⁰. Es ist auch wichtig darauf hinzuweisen, dass die Energielandschaft der Membranproteine²¹^,²² zeigt, dass Konformationsänderungen in Proteinen – notwendig für ihre regulatorische Rolle – über die ns-Zeitskalen²³ kollektiver Membranfluktuationen stattfinden, was die Bedeutung der mesoskopischen Dynamik in der biologischen Funktion von Zellmembranen und ihren bioinspirierten Analoga weiter unterstreicht²⁰. Dieser Beitrag konzentriert sich auf die beiden primären mesoskopischen dynamischen Modi in Lipidmembranen, nämlich Biegeschwankungen und Dickenschwankungen.

Die größte Herausforderung bei der direkten Untersuchung dieser Fluktuationsmodi ist die Schwierigkeit, gleichzeitig auf ihre räumlichen und zeitlichen Skalen mit Standardspektroskopiemethoden zuzugreifen. Die andere Herausforderung besteht darin, dass direkte Kontakttechniken die gleichen Schwankungen beeinflussen könnten, die sie messen sollen¹⁶. Dies wird durch die kompositorische und strukturelle Komplexität der biologischen Membranen²⁴,²⁵noch^verschärft,was zu inhomogenen Membranmerkmalen führt, einschließlich der Lipiddomänenbildung²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰ und Membranasymmetrie³¹^,³²^,³³– die selektive Sonden erfordern, um die Dynamik verschiedener Membranmerkmale zu verstehen. Glücklicherweise können diese Herausforderungen mit nicht-invasiven Neutronenspektroskopiemethoden wie Neutronenspinecho (NSE) überwunden werden, die von Natur aus auf die erforderlichen Längen- und Zeitskalen zugreifen und weitere Untersuchungen selektiver Membranmerkmale ermöglichen, ohne ihre physikalisch-chemische Umgebung zu verändern³⁴. Tatsächlich hat sich die NSE-Spektroskopie in den letzten Jahren zu einer einzigartigen und leistungsstarken Sonde der kollektiven Membrandynamik entwickelt³⁵. Ergebnisse aus NSE-Studien an Lipidmembranen haben neue Erkenntnisse über mechanische³⁶^,³⁷ und viskoelastische³⁸^,³⁹ Eigenschaften von Lipidmembranen geliefert und ein neues Licht auf ihre mögliche Rolle in der biologischen Funktion geworfen⁴⁰^,⁴¹.

Die NSE-Spektroskopietechnik basiert auf einem interferometrischen Instrumentendesign, das erstmals von Mezei⁴²vorgeschlagen wurde und eine Reihe von Spin-Flippern und Magnetspulen verwendet, um die Präzession des Neutronenspins zu steuern, während Neutronen das Instrument durchqueren. Das Design beruht auf der magnetischen Spiegelung der Magnetfeldelemente in Bezug auf die Probenposition (Abbildung 1A). Dies bedeutet, dass das Neutron in Abwesenheit eines Energieaustauschs zwischen dem Neutron und der Probe in der ersten und zweiten Hälfte des Instruments die gleiche Anzahl von Spin-Präzessionen in entgegengesetzte Richtungen durchführt (beachten Sie den π-Flipper zwischen den beiden Präzessionsspulen). Infolgedessen bleibt der endgültige Spinzustand des Neutrons relativ zum Ausgangszustand unverändert – ein Phänomen, das als Spin-Echo bezeichnet wird (siehe transparentes Neutron in Abbildung 1A). Wenn das Neutron jedoch energetisch mit der Probe wechselwechselt, verändert der Energieaustausch die Anzahl der Spin-Präzessionen in der zweiten Hälfte des Instruments, was zu einem anderen endgültigen Spin-Zustand führt (siehe Abbildung 1A). Dies wird experimentell als Polarisationsverlust nachgewiesen, wie später in diesem Artikel gezeigt wird. Für weitere Einzelheiten zur NSE-Technik wird der Leser auf die speziellen technischen Papiere⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵verwiesen.

Hier wird eine vereinfachte Beschreibung präsentiert, um eine grobe Schätzung der Längen- und Zeitskalen zu liefern, die mit NSE zugänglich sind. Die Längenskalen werden durch den Bereich der erreichbaren Wellenvektortransfers bestimmt, Q = 4π sin θ/λ, wobei 2θ der Streuwinkel und λ die Neutronenwellenlänge ist. Man kann sehen, dass Q durch den Wellenlängenbereich und das Ausmaß der Rotation des zweiten Arms des Spektrometers eingestellt wird (siehe Abbildung 1A). Ein typischer Q-Bereichauf NSE-Spektrometern ist ~0,02-2 Å^-1⁴⁶^,⁴⁷und bis zu 0,01-4 Å^-1 mit den jüngsten Upgrades⁴⁸^,⁴⁹, entsprechend räumlichen Skalen von ~ 1-600 Å. Auf der anderen Seite wird die zugängliche Zeitskala aus dem gesamten Präzessionswinkel (oder der Phase) berechnet, der vom Neutron innerhalb der magnetischen Präzessionsspulen erfasst wird, und es wird festgestellt, dass^{es 50}: . In diesem Ausdruck ist t die Fourierzeit, definiert als , wobei das Neutronen-Gyromagnet-Verhältnis, die Spulenlänge und die Stärke des Magnetfeldes der Spule ist. Es ist erwähnenswert, dass die Fourierzeit eine Größe ist, die streng von der Instrumentengeometrie, der Magnetfeldstärke und der Neutronenwellenlänge abhängt. Zum Beispiel wird die Fourierzeit unter Verwendung von Neutronen mit einer Wellenlänge = 8 Å und Instrumenteneinstellungen von = 1,2 m und = 0,4 T als t ~ 50 ns berechnet. Experimentell wird die Fourierzeit durch Änderung des Stroms in den Präzessionsspulen (d. H. Magnetfeldstärke) oder unter Verwendung verschiedener Neutronenwellenlängen abgestimmt, was zu typischen NSE-Zeitskalen von ~ 1 ps bis 100 ns führt. Jüngste Upgrades bei NSE-Spektrometern haben jedoch den Zugriff auf längere Fourier-Zeiten ermöglicht, bis zu ~ 400 ns auf dem J-NSE-Phoenix-Spektrometer am Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ und dem SNS-NSE-Spektrometer am Oak Ridge National Lab⁴⁸und bis zu ~ 1.000 ns am IN15 NSE-Spektrometer am Institut Laue-Langevin (ILL)⁴⁹.

Neben dem direkten Zugriff auf die Längen- und Zeitskala der Membrandynamik verfügt NSE über die inhärenten Fähigkeiten der Neutronenisotopenempfindlichkeit⁵². Insbesondere die Fähigkeit von Neutronen, unterschiedlich mit den Isotopen von Wasserstoff, dem am häufigsten vorkommenden Element in biologischen Systemen, zu interagieren, führt zu einer anderen Neutronenstreulängendichte,³⁴ oder NSLD (das Äquivalent des optischen Brechungsindex^50),wenn Protium durch Deuterium ersetzt wird. Dies ermöglicht einen Ansatz, der als Kontrastvariation bekannt ist und häufig verwendet wird, um bestimmte Membranmerkmale hervorzuheben oder andere zu verbergen – das letztere Szenario wird als Kontrastabgleich bezeichnet. Eine häufige Anwendung von Kontrastvariation/Matching ist die Substitution von Wasser (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2) durch schweres Wasser oder_D2O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2), um das Neutronensignal von protiierten Lipidmembranen (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2) zu verstärken. Dieser Ansatz ist bei Untersuchungen der Membranstruktur sehr effektiv, da das Eindringen von_D2Oin den Kopfgruppenbereich der Membran eine genaue Bestimmung der Membrandicken (siehe Abbildung 2A, linkes Feld) und der Lage verschiedener Lipiduntergruppen ermöglicht, wenn anspruchsvollere Modelle angewendet werden⁵³^,⁵⁴. Dieser Artikel hebt einige Beispiele für die Verwendung von Kontrastvariationen für Studien der kollektiven Dynamik in biomimetischen Membranen und ausgewählten Membranmerkmalen hervor.

Hier wird die Wirksamkeit von NSE bei der Bereitstellung einzigartiger Einblicke in dynamische und funktionelle Membraneigenschaften anhand konkreter Beispiele von NSE-Studien zu Modell- und biologisch relevanten Lipidmembransystemen mit Schwerpunkt auf mesoskaliger Dynamik in freistehenden Membranen in Form von liposomalen Suspensionen veranschaulicht. Für NSE-Messungen der In-Plane-Membrandynamik wird der Leser auf spezielle Publikationen zur Grazing-Incidence-Neutronen-Spin-Echo-Spektroskopie (GINSES)⁵⁵^,⁵⁶ und andere Studien von ausgerichteten multilamellaren Membranstapeln⁵⁷^,⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰verwiesen.

Der Einfachheit halber hebt dieser Artikel drei verschiedene Schemata der Membrandeuteration hervor, die auf einem gut untersuchten domänenbildenden oder phasenabtrennenden Lipiddoppelschichtsystem aus 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) -Mischungen⁶¹^,⁶²dargestellt werden. Die beiden Lipide zeichnen sich durch eine Diskrepanz in ihrer Kohlenwasserstoffkettenlänge (14 Kohlenstoffe / Schwanz in DMPC vs. 18 Kohlenstoffe / Schwanz in DSPC) und ihrer Gel-Fluid-Übergangstemperatur (T_{m, DMPC} = 23 ° C vs T_{m, DSPC} = 55 ° C) aus. Dies führt zu einer lateralen Phasentrennung in DMPC:DSPC-Membranen bei Temperaturen zwischen der oberen und unteren Übergangstemperatur des Gemisches^63. Die hier betrachteten Deuterationsschemata werden ausgewählt, um die verschiedenen dynamischen Modi zu demonstrieren, die bei NSE-Messungen auf liposomalen Membranen verfügbar sind, nämlich Biegefluktuationen, Dickenschwankungen und selektive Biege-/Dickenschwankungen von lateralen Domänen. Alle Lipidzusammensetzungen werden für DMPC:DSPC-Doppelschichten berichtet, die mit einem Molanteil von 70:30 unter Verwendung handelsüblich erhältlicher protiated und perdeuterated Varianten von DMPC und DSPC hergestellt wurden. Alle Probenvorbereitungsschritte basieren auf 4 ml liposomaler Suspension in_D2O mit einer Lipidkonzentration von 50 mg/ml für eine Gesamtlipidmasse von M_tot = 200 mg pro Probe.

Protocol

1. Für das Experiment erforderliches Deuterationsschema Für Biegeschwankungsmessungen werden vollständig protiierte Liposomen inD2O(D 99,9%) oderD2O-Puffer (z. B. Phosphatpuffer mitD2Oanstelle vonH2Ohergestellt) hergestellt. Verwenden Sie vollständig protiierte DMPC (C36H72NO8P) und DSPC (C44H88NO8P) mit 133,4 mg, wobei X<…

Representative Results

NSE-Studien, die auf Biegeschwankungen zugreifen, werden typischerweise über einen Q-Bereich von ~ (0,04 – 0,2) Å-1durchgeführt. Dieser Q-Bereich entspricht mittleren Längenskalen zwischen der Membrandicke und dem liposomalen Radius, wobei die Biegedynamik dominiert. Die Messung über einen erweiterten Q-Bereich kann den Zugang zu zusätzlichen dynamischen Modi ermöglichen, einschließlich liposomaler Diffusion und Intramembrandynamik. Weitere Einzelheiten zum Crossover in der Membrandynamik, auf das NSE …

Discussion

NSE ist eine leistungsstarke und einzigartige Technik zur Messung der mesoskopischen Dynamik von Lipidmembranen unter verschiedenen Bedingungen. Die effektive Nutzung von NSE hängt von der Probenqualität, dem Neutronenkontrast und dem Bereich der zugänglichen Dynamik ab, die für eine bestimmte Probe untersucht werden kann. Daher sind mehrere kritische Schritte erforderlich, um erfolgreiche NSE-Experimente durchzuführen und qualitativ hochwertige Daten zu sammeln. Ein wichtiger Schritt, um die effektive Nutzung der N…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R. Ashkar dankt M. Nagao, L.-R. Stingaciu und P. Zolnierczuk für viele nützliche Diskussionen und für ihre häufige Unterstützung bei NSE-Experimenten auf ihren jeweiligen Beamlines. Die Autoren erkennen den Einsatz von Neutronenspin-Echospektrometern am NIST und ORNL an. Das NSE-Spektrometer am NIST wird vom Center for High Resolution Neutron Scattering unterstützt, einer Partnerschaft zwischen dem National Institute of Standards and Technology und der National Science Foundation unter der Vereinbarung Nr. DMR-1508249. Das NSE-Spektrometer an der Spallations-Neutronenquelle des ORNL wird von der Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy, unterstützt. Das Oak Ridge National Laboratory wird von UT-Battelle, LLC unter der US DOE Contract No. DE-AC05-00OR22725.

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D₂O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples

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Kumarage, T., Nguyen, J., Ashkar, R. Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (171), e62396, doi:10.3791/62396 (2021).