Espectroscopia de Eco de Rotação de Nêutrons como uma sonda única para dinâmicas de membrana lipídica e interações membrana-proteína

Summary

Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

Abstract

Bicamadas lipídicas formam a principal matriz das membranas celulares e são a principal plataforma de troca de nutrientes, interações proteína-membrana e brotamento viral, entre outros processos celulares vitais. Para uma atividade biológica eficiente, as membranas celulares devem ser rígidas o suficiente para manter a integridade da célula e seus compartimentos, mas fluidas o suficiente para permitir que componentes de membrana, como proteínas e domínios funcionais, difundam e interajam. Este delicado equilíbrio de propriedades de membrana elástica e fluida, e seu impacto na função biológica, necessitam de uma melhor compreensão da dinâmica da membrana coletiva sobre o comprimento mesoscópico e escalas de tempo dos principais processos biológicos, por exemplo, deformações de membrana e eventos de ligação de proteínas. Entre as técnicas que podem efetivamente sondar esse alcance dinâmico está a espectroscopia de nêutrons spin echo (NSE). Combinado com a rotulagem de deutério, o NSE pode ser usado para acessar diretamente flutuações de dobra e espessura, bem como dinâmica mesoscópica de características de membrana selecionadas. Este artigo fornece uma breve descrição da técnica NSE e descreve os procedimentos para a realização de experimentos NSE em membranas liposômicas, incluindo detalhes de esquemas de preparação e deuteração da amostra, juntamente com instruções para coleta e redução de dados. O artigo também introduz métodos de análise de dados usados para extrair parâmetros de membrana chave, como o módulo de rigidez de dobra, o módulo de compressão da área e a viscosidade no plano. Para ilustrar a importância biológica dos estudos da NSE, são discutidos exemplos selecionados de fenômenos de membrana sondados pela NSE, ou seja, o efeito dos aditivos sobre a rigidez de dobra de membrana, o impacto da formação de domínios sobre as flutuações da membrana e a assinatura dinâmica das interações membrana-proteína.

Introduction

A compreensão das membranas celulares e sua função evoluiu notavelmente nas últimas décadas. A visão anterior das membranas celulares como bicamadas lipídicas passivas que definem limites celulares e proteínas de membrana^{doméstica 1} gradualmente se transformou em um modelo dinâmico no qual bicamadas lipídicas desempenham um papel importante na regulação de processos biológicos vitais, incluindo sinalização celular, troca molecular e função proteica — para citar alguns^2,3,4,5,6. Essa constatação de que as membranas celulares são altamente dinâmicas, constantemente submetidas à remodelação e redistribuição molecular, tem incitado explorações científicas além das estruturas de equilíbrio das membranas^7,8,9. Assim, várias abordagens foram desenvolvidas para estudar os diversos modos dinâmicos em membranas lipídicas biológicas e bioinspiradas. Até o momento, a maioria desses estudos se concentrou principalmente nos movimentos moleculares difusivos^10,11,12,13 e flutuações de forma macroscópica^14,15,16, deixando uma lacuna significativa na compreensão da dinâmica da membrana intermediária, ou seja, flutuações coletivas de conjuntos lipídicos consistindo de poucos 10-100s de moléculas lipídicas. Essas dinâmicas ocorrem ao longo de escalas de comprimento de poucas dezenas a poucos 100 Å e ao longo do tempo escalas de sub-ns a algumas centenas de ns (ver Figura 1), referidas aqui como escalas mesoscópicas. É nestas escalas que a atividade biológica chave ocorre no nível de membrana¹⁷. Isso inclui o brotamento viral¹⁸, gating canal¹⁹e interações membrana-proteína²⁰. Também é importante ressaltar que a paisagem energética das proteínas da membrana^21,22 mostra que as alterações conformais nas proteínas — necessárias para seu papel regulatório — acontecem ao longo das escalas de tempo^{ns 23} de flutuações coletivas de membrana, enfatizando ainda mais a importância da dinâmica mesoscópica na função biológica das membranas celulares e seus analógicos bioinspirados²⁰. Este artigo se concentra nos dois modos dinâmicos mesoscópicos primários em membranas lipídicas, ou seja, flutuações de dobra e flutuações de espessura.

O principal desafio em sondar diretamente esses modos de flutuação é a dificuldade em acessar simultaneamente suas escalas espaciais e temporais usando métodos de espectroscopia padrão. O outro desafio é que as técnicas de contato direto podem impactar as mesmas flutuações que se destinam a medir¹⁶. Isso é ainda mais exacerbado pela complexidade composicional e estrutural das membranas biológicas^24,25, o que resulta em características de membrana não homogênea, incluindo a formação de domínio lipídudo^{26,27,28,29,30} e assimetria de membrana 31^,32,33– exigindo sondas seletivas para entender a dinâmica de diferentes características da membrana. Felizmente, esses desafios podem ser superados com métodos não invasivos de espectroscopia de nêutrons, como o echo de giro de nêutrons (NSE), que acessam inerentemente o comprimento e as escalas de tempo necessárias, e permitem ainda estudos de características de membrana seletiva sem alterar seu ambiente físico-químico³⁴. De fato, nos últimos anos a espectroscopia NSE evoluiu para uma sonda única e poderosa da dinâmica da membrana coletiva³⁵. Os resultados de estudos da NSE sobre membranas lipídicas produziram novos insights sobre as propriedades mecânica^36,37 e viscoelástica^38,39 de membranas lipídicas e lançaram uma nova luz sobre seu potencial papel na função biológica^40,41.

A técnica de espectroscopia NSE é baseada em um design de instrumento interferométrico, proposto pela primeira vez por Mezei⁴², usando uma série de giradoras e bobinas magnéticas para controlar a precessão do giro de nêutrons à medida que os nêutrons atravessam o instrumento. O desenho repousa no espelhamento magnético dos elementos do campo magnético em relação à posição da amostra(Figura 1A). Isso implica que, na ausência de troca de energia entre o nêutron e a amostra, o nêutron realiza o mesmo número de precessões de spin, em direções opostas, na primeira e segunda metade do instrumento (observe o π-flipper entre as duas bobinas de pré-cessão). Como resultado, o estado final de rotação do nêutron permanece inalterado em relação ao estado inicial – um fenômeno referido como spin-echo (ver nêutron transparente na Figura 1A). No entanto, quando o nêutron interage energeticamente com a amostra, a troca de energia modifica o número de precessões de spin na segunda metade do instrumento, levando a um estado de rotação final diferente (ver Figura 1A). Isso é detectado experimentalmente como uma perda de polarização, como será mostrado mais tarde neste artigo. Para mais detalhes sobre a técnica NSE, o leitor é encaminhado para documentos técnicos dedicados^42,43,44,45.

Aqui, uma descrição simplificada é apresentada para fornecer uma estimativa aproximada do comprimento e escalas de tempo acessíveis com a NSE. As escalas de comprimento são determinadas pela faixa de transferências de vetores de onda alcançáveis, Q = 4π sin φ/λ, onde 2φ é o ângulo de dispersão e λ é o comprimento de onda de nêutrons. Pode-se ver que Q é definido pela faixa de comprimento de onda e a extensão da rotação do segundo braço do espectrômetro (ver Figura 1A). Uma faixa típica de Qnos espectrômetros NSE é ~0,02-2 Å^-146,47, e até 0,01-4 Å^-1 com atualizações recentes^48,49, correspondentes a escalas espaciais de ~1-600 Å. Por outro lado, a escala de tempo acessível é calculada a partir do ângulo total de precessão (ou fase) adquirido pelo nêutron dentro das bobinas de precessão magnética, e é encontrado como⁵⁰: . Nesta expressão, t é o tempo de Fourier definido como , onde está a razão gyrommagnética de nêutrons, é o comprimento da bobina, e é a força do campo magnético da bobina. Vale ressaltar que o tempo de Fourier é uma quantidade estritamente dependente da geometria do instrumento, força do campo magnético e comprimento de onda de nêutrons. Por exemplo, usando nêutrons de comprimento de onda = 8 Å e configurações de instrumentos de   = 1,2 m e = 0,4 T, o tempo de Fourier é calculado para ser t ~ 50 ns. Experimentalmente, o tempo de Fourier é sintonizado alterando a corrente nas bobinas de precessão (ou seja, força do campo magnético) ou usando diferentes comprimentos de onda de nêutrons, resultando em escalas típicas de tempo NSE de ~ 1 ps a 100 ns. No entanto, os upgrades recentes nos espectrômetros NSE permitiram o acesso a tempos mais longos do Fourier, até ~400 ns no espectrômetro J-NSE-Phoenix no espectrômetro Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ e no espectrômetro SNS-NSE no Oak Ridge National Lab⁴⁸, e até ~1.000 ns no espectrômetro IN15 NSE no Institut Laue-Langevin (III)⁴⁹. 

Além do acesso direto ao comprimento e escala de tempo da dinâmica da membrana, a NSE possui as capacidades inerentes à sensibilidade ao isótopo de nêutrons⁵². Especificamente, a capacidade dos nêutrons de interagir de forma diferente com os isótopos do hidrogênio, o elemento mais abundante em sistemas biológicos, resulta em uma densidade de comprimento de dispersão de nêutrons diferente,³⁴ ou NSLD (o equivalente ao índice óptico de refração⁵⁰), quando o prótium é substituído por deutério. Isso permite uma abordagem conhecida como variação de contraste, que é comumente usada para destacar características específicas da membrana ou ocultar outras — este último cenário é referido como correspondência de contraste. Uma aplicação frequente de variação/correspondência de contraste é a substituição de água (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2) por água pesada ou D₂O (NSLD = 6,6 4 × 10^-6 Å^-2) para amplificar o sinal de nêutrons de membranas lipídicas protiadas (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Essa abordagem é altamente eficaz em estudos de estrutura de membrana porque a penetração de D₂O na região do headgroup da membrana permite a determinação precisa das espessuras da membrana (ver Figura 2A, painel esquerdo) e da localização de diferentes subgrupos lipídes quando modelos mais sofisticados são aplicados^53,54. Este artigo destaca alguns exemplos sobre o uso de variação de contraste para estudos de dinâmica coletiva em membranas biomiméticas e características de membrana selecionadas.

Aqui, a eficácia da NSE em fornecer insights únicos sobre propriedades de membrana dinâmica e funcional é ilustrada através de exemplos tangíveis de estudos NSE sobre sistemas de membrana lipídica modelo e biologicamente relevantes com ênfase na dinâmica da mesoescala em membranas autônomas, na forma de suspensões liposômicas. Para as medições NSE da dinâmica da membrana in-plane, o leitor é encaminhado para publicações dedicadas sobre espectroscopia de spin-echo de nêutrons de incidência de pastagem (GINSES)^55,56 e outros estudos de pilhas de membrana multilamelar^{alinhadas 57,58,59,60}.

Para simplificar, este artigo destaca três diferentes esquemas de deuteração de membrana ilustrados em uma formação de domínio bem estudada, ou separação de fase, sistema de bicamadas lipídicas de misturas 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosphocholina (DMPC) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) misturas^61,62. Os dois lipídios são caracterizados por uma incompatibilidade em seu comprimento da cadeia de hidrocarbonetos (14 carbonos/cauda em DMPC vs 18 carbonos/cauda em DSPC) e sua temperatura de transição gel-fluido (T_{m, DMPC} = 23 °C vs T_{m, DSPC} = 55 °C). Isso resulta na separação lateral de fases nas membranas DMPC:DSPC a temperaturas entre as temperaturas de transição superior e inferior da mistura⁶³. Os esquemas de deuteração aqui considerados são escolhidos para demonstrar os diferentes modos dinâmicos acessíveis nas medidas NSE em membranas lipoesômicas, ou seja, flutuações de dobra, flutuações de espessura e flutuações seletivas de dobra/espessura dos domínios laterais. Todas as composições lipídicas são relatadas para bicamadas DMPC:DSPC preparadas a uma fração toupeira de 70:30, utilizando variantes protiadas e semeadas comercialmente disponíveis de DMPC e DSPC. Todas as etapas de preparação da amostra são baseadas em 4 mL de suspensão liposômica, em D₂O, com concentração lipídica de 50 mg/mL, para uma massa lipídica total de M_tot = 200 mgs por amostra.

Protocol

1. Esquema de desauteização necessário para o experimento Para medir a flutuação de dobra, faça lipossomos totalmente protiados em D2O (D 99,9%) ou D2O-buffer (por exemplo, tampão fosfato preparado com D2O em vez de H2O). Use DMPC totalmente protiado (C36H72NO8P) e DSPC (C44H88NO8P) com 133,4 mgs, onde XDMPC …

Representative Results

Estudos NSE acessando flutuações de dobra são normalmente realizados ao longo de uma faixa Q de ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Esta faixa Q corresponde a escalas de comprimento intermediário entre a espessura da membrana e o raio lipossômico, onde a dinâmica de dobra domina. A medição sobre um intervalo Q estendido pode dar acesso a modos dinâmicos adicionais, incluindo difusão liposômica e dinâmica intramembrana. Para obter mais detalhes sobre o cruzamento na dinâmica da membrana acessada pela NSE, consult…

Discussion

NSE é uma técnica poderosa e única na medição da dinâmica mesoscópica das membranas lipídicas sob várias condições. A utilização efetiva da NSE depende da qualidade da amostra, do contraste de nêutrons e da gama de dinâmicas acessíveis que podem ser sondadas para uma determinada amostra. Assim, várias etapas críticas são necessárias para a realização de experimentos NSE bem-sucedidos e a coleta de dados de alta qualidade. Um passo fundamental para garantir o uso efetivo do tempo de feixe de nêutron…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples