Spettroscopia eco-spin neutronica come sonda unica per la dinamica della membrana lipidica e le interazioni membrana-proteina

Summary

Questo documento descrive i protocolli per la preparazione dei campioni, la riduzione dei dati e l’analisi dei dati negli studi NSE (Neutron Spin Echo) delle membrane lipidiche. L’etichettatura giudiziosa dei lipidi al deuterio consente l’accesso a diverse dinamiche di membrana su scale di lunghezza e tempo mesoscopiche, su cui si verificano processi biologici vitali.

Abstract

I doppi strati lipidici formano la matrice principale delle membrane cellulari e sono la piattaforma primaria per lo scambio di nutrienti, le interazioni proteina-membrana e il germogliamento virale, tra gli altri processi cellulari vitali. Per un’attività biologica efficiente, le membrane cellulari dovrebbero essere abbastanza rigide da mantenere l’integrità della cellula e dei suoi compartimenti ma abbastanza fluide da consentire ai componenti della membrana, come proteine e domini funzionali, di diffondersi e interagire. Questo delicato equilibrio delle proprietà elastiche e fluide della membrana, e il loro impatto sulla funzione biologica, richiedono una migliore comprensione delle dinamiche collettive della membrana su scale mesoscopiche di lunghezza e tempo dei principali processi biologici, ad esempio deformazioni della membrana ed eventi di legame proteico. Tra le tecniche che possono sondare efficacemente questa gamma dinamica c’è la spettroscopia neutron spin echo (NSE). In combinazione con l’etichettatura al deuterio, nSE può essere utilizzato per accedere direttamente alle fluttuazioni di flessione e spessore, nonché alla dinamica mesoscopica di caratteristiche selezionate della membrana. Questo documento fornisce una breve descrizione della tecnica NSE e delinea le procedure per l’esecuzione di esperimenti NSE su membrane liposomiali, compresi i dettagli della preparazione del campione e degli schemi di deuterazione, insieme alle istruzioni per la raccolta e la riduzione dei dati. Il documento introduce anche metodi di analisi dei dati utilizzati per estrarre i parametri chiave della membrana, come il modulo di rigidità di flessione, il modulo di comprimibilità dell’area e la viscosità nel piano. Per illustrare l’importanza biologica degli studi NSE, vengono discussi esempi selezionati di fenomeni di membrana sondati da NSE, vale a dire, l’effetto degli additivi sulla rigidità di flessione della membrana, l’impatto della formazione del dominio sulle fluttuazioni della membrana e la firma dinamica delle interazioni membrana-proteina.

Introduction

La comprensione delle membrane cellulari e della loro funzione si è notevolmente evoluta negli ultimi decenni. La precedente visione delle membrane cellulari come doppi strati lipidici passivi che definiscono i confini cellulari e le proteine di membrana¹ si è gradualmente trasformata in un modello dinamico in cui i doppi strati lipidici svolgono un ruolo importante nella regolazione dei processi biologici vitali, tra cui la segnalazione cellulare, lo scambio molecolare e la funzione proteica – per citarne alcuni^2,3,4,5,6. Questa consapevolezza che le membrane cellulari sono altamente dinamiche, costantemente in fase di rimodellamento e ridistribuzione molecolare, ha sollecitato esplorazioni scientifiche oltre le strutture di equilibrio delle membrane^7,8,9. Di conseguenza, sono stati sviluppati diversi approcci per studiare le varie modalità dinamiche nelle membrane lipidiche biologiche e bioispira. Ad oggi, la maggior parte di questi studi si è concentrata principalmente sui moti molecolari diffusivi^{10,11, 12,13} e sulle fluttuazioni macroscopiche della forma^14,15,16,lasciando un vuoto significativo nella comprensione della dinamica intermedia della membrana, cioè fluttuazioni collettive di assemblaggi lipidici costituiti da pochi 10-100 di molecole lipidiche. Queste dinamiche si verificano su scale di lunghezza da poche decine a poche 100 Å e su scale temporali di sub-ns a poche centinaia di ns (vedi Figura 1), qui indicate come scale mesoscopiche. È infatti su queste scale che l’attività biologica chiave si svolge a livello di membrana¹⁷. Ciò include il germogliamento virale^18,il gating del canale¹⁹e le interazioni membrana-proteina^20. È anche importante sottolineare che il panorama energetico delle proteine di membrana^21,22 mostra che i cambiamenti conformazionali nelle proteine – necessari per il loro ruolo regolatore – avvengono sulle scale temporali ns²³ delle fluttuazioni collettive della membrana, sottolineando ulteriormente l’importanza della dinamica mesoscopica nella funzione biologica delle membrane cellulari e dei loro analoghi bioispirati²⁰. Questo documento si concentra sulle due principali modalità dinamiche mesoscopiche nelle membrane lipidiche, vale a dire, fluttuazioni di flessione e fluttuazioni di spessore.

La sfida principale nel sondare direttamente queste modalità di fluttuazione è la difficoltà di accedere simultaneamente alle loro scale spaziali e temporali utilizzando metodi di spettroscopia standard. L’altra sfida è che le tecniche di contatto diretto potrebbero avere un impatto sulle stesse fluttuazioni che dovrebbero misurare¹⁶. Ciò è ulteriormente esacerbato dalla complessità composizionale e strutturale delle membrane biologiche^24,25, che si traduce in caratteristiche di membrana non omogenee, tra cui la formazione del dominio lipidico^{26,27,28,29,30} e l’asimmetria di membrana^31,32,33– che richiedono sonde selettive per comprendere la dinamica delle diverse caratteristiche della membrana. Fortunatamente, queste sfide possono essere superate con metodi di spettroscopia neutronica non invasivi, come l’eco di spin neutronico (NSE), che accedono intrinsecamente alle scale di lunghezza e tempo richieste e consentono ulteriormente studi sulle caratteristiche selettive della membrana senza modificare il loro ambiente fisico-chimico³⁴. Infatti, negli ultimi anni la spettroscopia NSE si è evoluta in una sonda unica e potente di dinamica collettiva della membrana³⁵. I risultati degli studi NSE sulle membrane lipidiche hanno prodotto nuove intuizioni sulle proprietà meccaniche^36,37 e viscoelastiche^38,39 delle membrane lipidiche e hanno gettato nuova luce sul loro potenziale ruolo nella funzione biologica^40,41.

La tecnica di spettroscopia NSE si basa su un progetto di strumento interferometrico, proposto per la prima volta da Mezei⁴², utilizzando una serie di pinne di spin e bobine magnetiche per controllare la precessione dello spin neutronico mentre i neutroni attraversano lo strumento. Il design si basa sulla specchiatura magnetica degli elementi del campo magnetico rispetto alla posizione del campione (Figura 1A). Ciò implica che in assenza di scambio di energia tra il neutrone e il campione, il neutrone esegue lo stesso numero di precessione di spin, in direzioni opposte, nella prima e nella seconda metà dello strumento (si noti la π-flipper tra le due bobine di precessione). Di conseguenza, lo stato di spin finale del neutrone rimane invariato rispetto allo stato iniziale – un fenomeno denominato spin-eco (vedi neutrone trasparente in Figura 1A). Tuttavia, quando il neutrone interagisce energeticamente con il campione, lo scambio di energia modifica il numero di precessione di spin nella seconda metà dello strumento, portando ad un diverso stato di spin finale (vedi Figura 1A). Questo è sperimentalmente rilevato come una perdita di polarizzazione, come verrà mostrato più avanti in questo articolo. Per maggiori dettagli sulla tecnica NSE, si rimanda al lettore gli articoli tecnici dedicati^42,43,44,45.

Qui viene presentata una descrizione semplificata per fornire una stima approssimativa della lunghezza e delle scale temporali accessibili con NSE. Le scale di lunghezza sono determinate dall’intervallo di trasferimenti di motovettori realizzabili, Q = 4π sin θ/λ, dove 2θ è l’angolo di diffusione e λ è la lunghezza d’onda del neutrone. Si può vedere che Q è impostato dall’intervallo di lunghezze d’onda e dall’estensione della rotazione del secondo braccio dello spettrometro (vedi Figura 1A). Un tipico intervallo Qsugli spettrometri NSE è ~ 0,02-2 Å^-146,47e fino a 0,01-4 Å^-1 con recenti aggiornamenti^48,49, corrispondenti a scale spaziali di ~ 1-600 Å. D’altra parte, la scala temporale accessibile è calcolata dall’angolo di precessione totale (o fase) acquisito dal neutrone all’interno delle bobine di precessione magnetica, e si trova ad essere⁵⁰: . In questa espressione, t è il tempo di Fourier definito come , dove è il rapporto giromagnetico neutronico, è la lunghezza della bobina e è la forza del campo magnetico della bobina. Vale la pena sottolineare che il tempo di Fourier è una quantità che dipende strettamente dalla geometria dello strumento, dall’intensità del campo magnetico e dalla lunghezza d’onda dei neutroni. Ad esempio, usando neutroni di lunghezza d’onda = 8 Å e impostazioni dello strumento di   = 1,2 m e = 0,4 T, il tempo di Fourier è calcolato per essere t ~ 50 ns. Sperimentalmente, il tempo di Fourier viene regolato modificando la corrente nelle bobine di precessione (cioè l’intensità del campo magnetico) o utilizzando diverse lunghezze d’onda dei neutroni, con conseguente scala temporale tipica di NSE da ~ 1 ps a 100 ns. Tuttavia, i recenti aggiornamenti degli spettrometri NSE hanno consentito l’accesso a tempi di Fourier più lunghi, fino a ~ 400 ns sullo spettrometro J-NSE-Phoenix presso lo spettrometro Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ e lo spettrometro SNS-NSE presso l’Oak Ridge National Lab⁴⁸e fino a ~ 1.000 ns presso lo spettrometro NSE IN15 presso l’Institut Laue-Langevin (ILL)⁴⁹. 

Oltre all’accesso diretto alla scala di lunghezza e tempo della dinamica di membrana, NSE ha le capacità intrinseche della sensibilità isotopica dei neutroni⁵². In particolare, la capacità dei neutroni di interagire in modo diverso con gli isotopi dell’idrogeno, l’elemento più abbondante nei sistemi biologici, si traduce in una diversa densità di lunghezza di scattering neutronico,³⁴ o NSLD (l’equivalente dell’indice ottico di rifrazione⁵⁰), quando il prozio è sostituito dal deuterio. Ciò consente un approccio noto come variazione di contrasto, che viene comunemente utilizzato per evidenziare specifiche caratteristiche della membrana o nascondene altre – quest’ultimo scenario è indicato come corrispondenza di contrasto. Un’applicazione frequente di variazione/corrispondenza del contrasto è la sostituzione dell’acqua (NSLD = -0,56 ×^{10 -6 Å -2}) con acqua pesante o D₂O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2) per amplificare il segnale neutronico dalle membrane lipidiche protiate (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Questo approccio è altamente efficace negli studi sulla struttura della membrana perché la penetrazione di D₂O nella regione del gruppo di testa della membrana consente una determinazione accurata degli spessori della membrana (vedi Figura 2A,pannello di sinistra) e della posizione di diversi sottogruppi lipidici quando vengono applicati modelli più sofisticati^53,54. Questo documento evidenzia alcuni esempi sull’uso della variazione di contrasto per studi di dinamica collettiva in membrane biomimetiche e caratteristiche selezionate della membrana.

Qui, l’efficacia di NSE nel fornire approfondimenti unici sulle proprietà dinamiche e funzionali della membrana è illustrata attraverso esempi tangibili di studi NSE su sistemi di membrana lipidica modello e biologicamente rilevanti con particolare attenzione alla dinamica della mesoscala nelle membrane autoportanti, sotto forma di sospensioni liposomiali. Per le misure NSE della dinamica della membrana in-plane, il lettore è rimandato a pubblicazioni dedicate sulla spettroscopia spin-eco neutronica ad incidenza radente (GINSES)^55,56 e altri studi su pile di membrane multilamellari allineate^57,58,59,60.

Per semplicità, questo articolo evidenzia tre diversi schemi di deuterazione della membrana illustrati su un sistema a doppio strato lipidico ben studiato di formazione di dominio, o separazione di fase, di miscele di 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)^61,62. I due lipidi sono caratterizzati da una discrepanza nella lunghezza della catena idrocarburica (14 atomi di carbonio/coda in DMPC vs 18 atomi di carbonio/coda in DSPC) e dalla loro temperatura di transizione gel-fluido (T_{m, DMPC} = 23 °C vs T_{m, DSPC} = 55 °C). Ciò si traduce in una separazione di fase laterale nelle membrane DMPC:DSPC a temperature comprese tra le temperature di transizione superiore e inferiore della miscela^63. Gli schemi di deuterazione qui considerati sono scelti per dimostrare le diverse modalità dinamiche accessibili nelle misurazioni NSE su membrane liposomiali, vale a dire, fluttuazioni di flessione, fluttuazioni di spessore e fluttuazioni selettive di flessione / spessore di domini laterali. Tutte le composizioni lipidiche sono riportate per i doppi strati DMPC:DSPC preparati a una frazione molare di 70:30, utilizzando varianti proziate e perdeuterate disponibili in commercio di DMPC e DSPC. Tutte le fasi di preparazione del campione si basano su 4 mL di sospensione liposomiale, in D₂O, con una concentrazione lipidica di 50 mg/mL, per una massa lipidica totale di M_tot = 200 mg per campione.

Protocol

1. Schema di deuterazione richiesto per l’esperimento Per le misurazioni delle fluttuazioni di flessione, effettuare liposomi completamente proziati in D2O (D 99,9%) o D2O-buffer (ad esempio, tampone fosfato preparato con D2O invece di H2O). Utilizzare DMPC completamente proziato (C36H72NO8P) e DSPC (C44H88NO8P) con 133,4 mg, dove …

Representative Results

Gli studi NSE che accedono alle fluttuazioni di flessione vengono in genere eseguiti su un intervallo Q di ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Questo intervallo Q corrisponde a scale di lunghezza intermedie tra lo spessore della membrana e il raggio liposomiale, dove dominano le dinamiche di flessione. La misurazione su un intervallo Q esteso può dare accesso a modalità dinamiche aggiuntive, tra cui la diffusione liposomiale e la dinamica intramembrana. Per maggiori dettagli sul cross-over nella dinamica delle membrane a c…

Discussion

NSE è una tecnica potente e unica nella misurazione della dinamica mesoscopica delle membrane lipidiche in varie condizioni. L’utilizzo efficace di NSE dipende dalla qualità del campione, dal contrasto neutronico e dalla gamma di dinamiche accessibili che possono essere sonde per un determinato campione. Pertanto, sono necessari diversi passaggi critici per eseguire esperimenti NSE di successo e raccogliere dati di alta qualità. Un passo fondamentale per garantire l’uso efficace del tempo del fascio di neutroni durant…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples