JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Overvågning af dynamisk vækst af retinale kar i oxygeninduceret retinopati musemodel

Published: April 02, 2021
doi:
10.3791/62410
,
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center,Sun Yat-Sen University

Summary

Denne protokol beskriver en detaljeret metode til fremstilling og immunfluorescensfarvning af mus retinale flade monteringer og analyse. Brugen af fluorescein fundus angiografi (FFA) til museunger og billedbehandling er også beskrevet detaljeret.

Abstract

Oxygeninduceret retinopati (OIR) anvendes i vid udstrækning til at studere unormal karvækst i iskæmiske retinale sygdomme, herunder retinopati af præmaturitet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal veneokklusion (RVO). De fleste OIR-undersøgelser observerer retinal neovaskularisering på bestemte tidspunkter; Imidlertid er den dynamiske fartøjsvækst hos levende mus langs et tidsforløb, som er afgørende for at forstå de OIR-relaterede karsygdomme, blevet undervurderet. Her beskriver vi en trin-for-trin protokol til induktion af OIR-musemodellen, fremhæver de potentielle faldgruber og giver en forbedret metode til hurtigt at kvantificere områder med vaso-udslettelse (VO) og neovaskularisering (NV) ved hjælp af immunfluorescensfarvning. Endnu vigtigere overvågede vi fartøjsgenvækst hos levende mus fra P15 til P25 ved at udføre fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musemodellen. Anvendelsen af FFA på OIR-musemodellen giver os mulighed for at observere ombygningsprocessen under genvækst af fartøjer.

Introduction

Retinal neovaskularisering (RNV), som er defineret som en tilstand, hvor nye patologiske kar stammer fra eksisterende retinale vener, strækker sig normalt langs nethindens indre overflade og vokser ind i det glasagtige (eller subretinale rum under nogle betingelser)1. Det er et kendetegn og fælles træk ved mange iskæmiske retinopatier, herunder retinopati af præmaturitet (ROP), retinal vene okklusion (RVO) og proliferativ diabetisk retinopati (PDR)2.

Talrige kliniske og eksperimentelle observationer har vist, at iskæmi er hovedårsagen til retinal neovaskularisering 3,4. I ROP udsættes nyfødte for ilt på højt niveau i lukkede inkubatorer for at øge overlevelsesraten, hvilket også er en vigtig drivkraft for anholdelse af vaskulær vækst. Efter behandlingen er udført, oplever nethinden hos nyfødte en relativt hypoxisk periode5. Andre situationer ses i okklusion af centrale eller gren retinale vener i RVO, og der observeres også skader på retinale kapillærer, som er forårsaget af mikroangiopati i PDR2. Hypoxi øger yderligere ekspressionen af angiogene faktorer såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) gennem den hypoxi-inducerede faktor-1α (HIF-1α) signalvej, som igen styrer vaskulære endotelceller til at vokse ind i det hypoxiske område og danne nye kar 6,7.

ROP er en slags vaskulær proliferativ retinopati hos for tidligt fødte spædbørn og en førende årsag til barndomsblindhed 8,9, som er karakteriseret ved retinal hypoxi, retinal neovaskularisering og fibrøs hyperplasi10,11,12. I 1950’erne fandt forskere, at høj koncentration af ilt kan forbedre respiratoriske symptomer hos for tidligt fødte spædbørn13,14. Som følge heraf blev iltbehandling i stigende grad anvendt til for tidligt fødte spædbørn på det tidspunkt15. Men samtidig med den udbredte brug af iltbehandling hos for tidligt fødte spædbørn steg forekomsten af ROP år for år. Siden da har forskere knyttet ilt til ROP og udforsket forskellige dyremodeller for at forstå patogenesen af ROP og RNV16.

Hos mennesker er det meste retinal vaskulaturudvikling afsluttet før fødslen, mens retinal vaskulaturen hos gnavere udvikler sig efter fødslen, hvilket giver et tilgængeligt modelsystem til at studere angiogenese i retinal vaskulatur2. Med forskningens fortsatte fremskridt er oxygeninducerede retinopati (OIR) modeller blevet vigtige modeller til efterligning af patologisk angiogenese som følge af iskæmi. Der er ingen specifikke dyrearter i studiet af OIR-modellen, og modellen er udviklet i forskellige dyrearter, herunder killing 17, rotte18, mus19, beaglehvalp 20 og zebrafisk21. Alle modellerne deler den samme mekanisme, hvormed de udsættes for hyperoxi under tidlig retinal udvikling og derefter vender tilbage til det normoxiske miljø. Smith et al. observerede, at udsættelse af museunger for hyperoxi fra P7 i 5 dage inducerede en ekstrem form for karregression i den centrale nethinde og bragte dem tilbage til rumluften ved P12 udløste gradvist neovaskulære tufts, som voksede mod glaslegemet19. Dette var en standardiseret OIR-musemodel, der også blev navngivet som Smith-model. Connor et al. optimerede protokollen yderligere og leverede en universelt anvendelig metode til kvantificering af arealet af VO (vaso-obliteration) og NV (neovaskularisering) i 2009, hvilket øgede accepten og udnyttelsen af model22. OIR-musemodellen er stadig den mest anvendte model nu på grund af dens lille størrelse, hurtige reproduktion, klare genetiske baggrund, gode repeterbarhed og høje succesrate.

Hos mus starter retinal vaskularisering efter fødslen med indvækst af kar fra det optiske nervehoved ind i den indre nethinde mod ora serrata. Under normal retinal udvikling spirer de første retinale kar fra synsnervehovedet omkring fødslen og danner et ekspanderende netværk (den primære plexus), der når periferien omkring postnatal dag 7 (P7) 23. Derefter begynder karrene at vokse ind i nethinden for at danne et dybt lag, trænge ind i nethinden og etablere et laminært netværk omkring det indre nukleare lag (INL) som hos menneske24. Ved udgangen af den tredje postnatale uge (P21) er dybere plexusudvikling næsten afsluttet. For OIR-musemodellen forekommer vaskulær okklusion altid i den centrale nethinden på grund af den hurtige degeneration af et stort antal umodne vaskulære netværk i det centrale område under hyperoxi-eksponering. Så væksten af patologisk neovaskularisering forekommer også i den midterste perifere nethinde, som er grænsen for ikke-perfusionsområdet og det vaskulære område. Imidlertid er menneskelige retinale kar næsten dannet før fødslen. Hvad angår for tidligt fødte spædbørn, er den perifere nethinde ikke fuldstændigt vaskulariseret, når den udsættes for hyperoxi25,26. Så vaskulær okklusion og neovaskularisering forekommer hovedsageligt i den perifere nethinde27,28. På trods af disse forskelle rekapitulerer musens OIR-model nøje de patologiske hændelser, der opstår under iskæmi-induceret neovaskularisering.

Induktionen af OIR-modellen kan opdeles i to faser29: i fase 1 (hyperoxifase) arresteres eller forsinkes retinal vaskulær udvikling med okklusion og regression af blodkar som følge af faldet i VEGF og apoptose af endotelceller 24,30; I fase 2 (hypoxifase) vil nethindens iltforsyning blive utilstrækkelig under rumluftforhold29, hvilket er afgørende for neural udvikling og homeostase 19,31. Denne iskæmiske situation resulterer normalt i ureguleret, unormal neovaskularisering.

I øjeblikket er den almindeligt anvendte modelleringsmetode skiftevis høj / lav ilteksponering: Mødre og deres hvalpe udsættes for 75% ilt i 5 dage ved P7 efterfulgt af 5 dage i rumluft, indtil P17 viste sammenlignelige resultater22, hvilket er endepunktet for OIR-musemodelinduktion. (Figur 1). Ud over at simulere ROP kan denne iskæmi-medierede patologiske neovaskularisering også bruges til at studere andre iskæmiske retinale sygdomme. De vigtigste målinger af denne model omfatter kvantificering af arealet af VO og NV, som analyseres fra retinale flade monteringer ved immunfluorescensfarvning eller FITC-dextranperfusion. Hver mus kan kun studeres én gang på grund af den dødelige operation. På nuværende tidspunkt er der få metoder til at observere dynamiske ændringer af retinal vaskulatur kontinuerligt under processen med vaskulær regression og patologisk angiogenese32. I dette papir giver vi en detaljeret protokol for OIR-modelinduktion, analyse af retinale flade monteringer samt en arbejdsgang af fluorescein fundus angiografi (FFA) på mus, hvilket ville være nyttigt for at få en mere omfattende forståelse af vaskulære dynamiske ændringer i to faser af OIR-musemodellen.

Protocol

Alle procedurer, der involverer brug af mus, blev godkendt af dyreforsøgsetisk komité ved Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Kina (autoriseret nummer: 2020-082) og i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer fra Animal Care and Use Committee of Zhongshan Ophthalmic Center og Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring til brug af dyr i oftalmisk og synsforskning. 1. Induktion af mus OIR model Brug mus med en lavere grad af medfødt mi…

Representative Results

I OIR-musemodellen er det vigtigste og grundlæggende resultat kvantificeringen af VO- og NV-området. Efter at have levet i hyperoxia-miljøet i 5 dage fra P7, viste hvalpenes centrale nethinde det største ikke-perfusionsområde. Under stimulering af hypoxi i yderligere 5 dage blev retinal neovaskularisering gradvist produceret, som fluorescerede mere intenst end omgivende normale kar. Efter P17 regresserede fluorescenssignalet for patologisk neovaskularisering hurtigt som ombygning af nethinden (f…

Discussion

Musens modtagelighed for OIR påvirkes af mange faktorer. Hvalpe med forskellig genetisk baggrund og stammer kan ikke sammenlignes. I BALB/c albinomus vokser karrene hurtigt ind i VO-området med signifikant reducerede neovaskulære tufts38, hvilket medfører nogle vanskeligheder for forskningen. Hos C57BL/6-mus er der øget fotoreceptorskade sammenlignet med BALB/cJ-musestamme39,40. Det samme gælder for forskellige typer transgene mus<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmer fra vores laboratorium og Ophthalmic Animal Laboratory of Zhongshan Ophthalmic Center for deres tekniske assistance. Vi takker også prof. Chunqiao Liu for eksperimentel støtte. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Beijing, Kina), Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen, Kina (tilskud nr. 2019A1515011347) og hospitalsbyggeri på højt niveau fra State Key Laboratory of Ophthalmology ved Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).

Materials

1 mL sterile syringe Solarbio YA0550 For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech  FG701-01 For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube Corning MCT-200-C For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3548 For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides Various For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019 Adobe Inc. For image analysis
Carbon dioxide gas Various For sacrifice
Cover slide Various For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps World Precision Instruments 14127 For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution Abcam ab228549 For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope Olmpus SZ61 For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium Sigma-Aldrich F6377 For in vivo imaging
Fluorescent Microscope  Zeiss AxioImager.Z2 For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech  0100-01 For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose Maya 89161 For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody Invitrogen I21413 For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J GemPharmatech of Jiangsu Province For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242 For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps World Precision Instruments  501978-6 For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum Abcam ab7475 For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor Various For monitoring the level of O2
OxyCycler Biospherix A84XOV For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG For tissue fixation
Pentobarbital sodium Various For anesthesia
Soda lime Various For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT Heidelberg HC00500002 For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0 IBM For statistical analysis
Tansference decloring shaker Kylin-Bell ZD-2008 For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment) Corning 3261-20EA For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes Various For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100 Sigma-Aldrich  SLBW6818 For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide Various For in vivo imaging
ZEN Imaging Software ZEISS For image acquisition and export
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 – Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
  4. Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), 7-17 (1957).
  5. Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
  6. Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473 (2018).
  7. Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
  8. Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O’Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
  9. Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
  10. Fielder, A., Blencowe, H., O’Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
  11. Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 69-73 (2006).
  12. Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
  13. Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
  14. Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
  15. Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
  16. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  17. Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
  18. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  19. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  20. McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
  21. Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748 (2008).
  22. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  23. Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
  24. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  25. Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241 (2017).
  26. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  27. Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
  28. Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
  29. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  30. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
  31. Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  32. Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  33. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  34. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
  35. McLeod, D. S., D’Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
  36. Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
  37. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  38. Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546 (2014).
  39. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  40. Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
  41. Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
  42. Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
  43. Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
  44. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  45. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  46. Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
  47. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  48. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
  49. Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
  50. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  51. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).

Tags

Keywords: Retinal VesselsOxygen-induced RetinopathyMouse ModelRetinal Whole MountingRetinal VasculatureRetinal SeparationEye Dissection
check_url/62410?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ma, Y., Li, T. Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model. J. Vis. Exp. (170), e62410, doi:10.3791/62410 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image