산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링
Summary
이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.
Abstract
산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 망막병증(ROP), 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR) 및 망막 정맥 폐색(RVO)을 포함한 허혈성 망막 질환에서 비정상적인 혈관 성장을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 대부분의 OIR 연구는 특정 시점에서 망막 신생 혈관을 관찰합니다. 그러나 OIR 관련 혈관 질환을 이해하는 데 필수적인 시간 경과에 따른 살아있는 마우스의 동적 혈관 성장은 연구되지 않았습니다. 여기에서는 OIR 마우스 모델의 유도를 위한 단계별 프로토콜을 설명하고, 잠재적인 위험을 강조하며, 면역형광 염색을 사용하여 혈관 소색(VO) 및 신생혈관(NV) 영역을 신속하게 정량화하는 개선된 방법을 제공합니다. 더 중요한 것은 OIR 마우스 모델에서 플루오레세인 안저 혈관조영술(FFA)을 수행하여 P15에서 P25까지의 살아있는 마우스에서 혈관 재성장을 모니터링했다는 것입니다. OIR 마우스 모델에 FFA를 적용하면 혈관 재성장 중 리모델링 과정을 관찰 할 수 있습니다.
Introduction
새로운 병리학 혈관이 기존 망막 정맥에서 시작되는 상태로 정의되는 망막 신생 혈관 형성 (RNV)은 일반적으로 망막의 내부 표면을 따라 확장되어 유리체 (또는 일부 조건에서는 망막 하 공간)로 성장합니다 1. 이는 미숙아 망막병증(ROP), 망막 정맥 폐색(RVO) 및 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR)을 포함한 많은 허혈성 망막병증의 특징이자 공통적인 특징입니다2.
수많은 임상 및 실험 관찰에 따르면 허혈이 망막 신생 혈관의 주요 원인입니다 3,4. ROP에서 신생아는 생존율을 높이기 위해 밀폐 된 인큐베이터에서 높은 수준의 산소에 노출되며, 이는 혈관 성장을 막는 중요한 동인이기도합니다. 치료가 끝나면 신생아의 망막은 상대적으로 저산소 기간을 경험합니다5. RVO에서 중앙 또는 가지 망막 정맥의 폐색에서 다른 상황이 나타나고 PDR2에서 미세 혈관 병증으로 인한 망막 모세 혈관의 손상도 관찰됩니다. 저산소증은 저산소증 유도 인자 -1α (HIF-1α) 신호 전달 경로를 통해 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 같은 혈관 형성 인자의 발현을 더욱 증가시켜 혈관 내피 세포가 저산소 영역으로 성장하고 새로운 혈관을 형성하도록 유도합니다 6,7.
ROP는 미숙아의 혈관 증식성 망막병증의 일종이며 망막 저산소증, 망막 신생혈관 및 섬유성 증식증10,11,12를 특징으로 하는 소아 실 명 8,9의 주요 원인입니다. 1950년대에 연구자들은 고농도의 산소가 미숙아의 호흡기 증상을 크게 개선할 수 있음을 발견했습니다13,14. 그 결과, 산소 요법은 그 당시 미숙아에서 점점 더 많이 사용되었습니다15. 그러나 미숙아에서 산소 요법이 널리 사용됨에 따라 ROP의 발병률은 해마다 증가했습니다. 그 이후로 연구자들은 산소를 ROP에 연결하여 ROP와 RNV16의 발병 기전을 이해하기 위해 다양한 동물 모델을 탐색했습니다.
인간의 경우 대부분의 망막 혈관 발달은 출생 전에 완료되는 반면 설치류에서는 망막 혈관 구조가 출생 후에 발달하여 망막 혈관 구조2에서 혈관 신생을 연구하기위한 접근 가능한 모델 시스템을 제공합니다. 연구의 지속적인 진행과 함께, 산소 유도 망막병증 (OIR) 모델은 허혈로 인한 병리학적 혈관신생을 모방하기 위한 주요 모델이 되었다. OIR 모델의 연구에는 특정 동물 종이 없으며 모델은 새끼 고양이 17, 쥐18, 마우스19, 비글 강아지 20 및 제브라 피쉬21을 포함한 다양한 동물 종에서 개발되었습니다. 모든 모델은 초기 망막 발달 동안 과산소증에 노출된 다음 정상 환경으로 되돌아가는 동일한 메커니즘을 공유합니다. Smith et al. 마우스 새끼를 P7의 과산소증에 5일 동안 노출시키면 중앙 망막에서 극단적인 형태의 혈관 퇴행이 유발되고 P12에서 실내 공기로 다시 가져오면 유리체(19)쪽으로 자라는 신생 혈관 술이 점차적으로 유발된다는 것을 관찰했습니다. 이것은 스미스 모델로도 명명 된 표준화 된 OIR 마우스 모델이었습니다. Connor et al.은 프로토콜을 더욱 최적화하고 2009 년에 VO (혈관 소멸) 및 NV (신생 혈관)의 면적을 정량화하기 위해 보편적으로 적용 가능한 방법을 제공하여 모델22의 수용과 활용도를 높였습니다. OIR 마우스 모델은 작은 크기, 빠른 번식, 명확한 유전적 배경, 우수한 반복성 및 높은 성공률로 인해 현재 가장 널리 사용되는 모델입니다.
생쥐에서 망막 혈관 형성은 출생 후 시신경 머리에서 혈관이 오라 세라 타쪽으로 망막 내부로 내 성장하면서 시작됩니다. 정상적인 망막 발달 동안 첫 번째 망막 혈관은 출생 전후 시신경 머리에서 돋아나 출생 후 7일(P7)23 주변의 주변에 도달하는 확장 네트워크(일차 신경총)를 형성합니다. 그런 다음 혈관은 망막으로 성장하기 시작하여 깊은 층을 형성하고 망막을 관통하며 인간24에서와 같이 내부 핵층 (INL) 주위에 층류 네트워크를 구축합니다. 출생 후 3 주 (P21)가 끝날 무렵, 더 깊은 신경총 발달이 거의 완료됩니다. OIR 마우스 모델의 경우, 혈관 폐색은 고 산소 노출 동안 중앙 영역에서 많은 수의 미성숙 혈관 네트워크의 급속한 퇴행으로 인해 항상 중심 망막에 나타납니다. 따라서 병리학 적 신생 혈관의 성장은 비 관류 영역과 혈관 영역의 경계 인 중간 말초 망막에서도 발생합니다. 그러나 인간의 망막 혈관은 출생 전에 거의 형성되었습니다. 미숙아의 경우, 말초 망막은 고 산소 증25,26에 노출되었을 때 완전히 혈관 화되지 않습니다. 따라서 혈관 폐색과 신생 혈관은 주로 말초 망막27,28에서 나타납니다. 이러한 차이에도 불구하고, 마우스 OIR 모델은 허혈-유도된 신생혈관형성 동안 발생하는 병리학적 사건을 면밀히 요약한다.
OIR 모델의 유도는 2 단계로 나눌 수 있습니다 (29) : 제 1 상 (고 옥시아 단계)에서, 망막 혈관 발달은 VEGF의 감소 및 내피 세포의 세포 사멸의 결과로 혈관의 폐색 및 퇴행으로 정지되거나 지연된다24,30; 2 단계 (저산소증 단계)에서는 망막 산소 공급이 실내 공기 조건 29 하에서 불충분 해지게되며, 이는 신경 발달 및 항상성19,31에 필수적입니다. 이 허혈성 상황은 일반적으로 조절되지 않은 비정상적인 신생 혈관을 초래합니다.
현재, 일반적으로 사용되는 모델링 방법은 고산소 / 저 산소 노출을 번갈아 가며 사용하는 것입니다 : 어미와 새끼는 P7에서 5 일 동안 75 % 산소에 노출 된 다음 P17이 OIR 마우스 모델 유도의 종점 인 비교 가능한 결과22를 입증 할 때까지 실내 공기에서 5 일 동안 노출됩니다. (그림 1). ROP를 시뮬레이션하는 것 외에도 이 허혈 매개 병리학적 신생혈관은 다른 허혈성 망막 질환을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 모델의 주요 측정에는 면역 형광 염색 또는 FITC- 덱스 트란 관류에 의해 망막 플랫 마운트에서 분석 된 VO 및 NV의 면적을 정량화하는 것이 포함됩니다. 각 마우스는 치명적인 수술 때문에 한 번만 연구 할 수 있습니다. 현재, 혈관 퇴행 및 병리학 적 혈관 신생 과정 동안 망막 혈관계의 동적 변화를 지속적으로 관찰하는 방법은 거의 없다32. 이 백서에서는 OIR 마우스 모델의 두 단계에서 혈관 동적 변화에 대한 보다 포괄적인 이해를 얻는 데 도움이 될 마우스에 대한 플루오레세인 안저 혈관 조영술(FFA)의 워크플로뿐만 아니라 OIR 모델 유도, 망막 플랫 마운트 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
OIR에 대한 마우스의 감수성은 많은 요인에 의해 영향을받습니다. 다른 유전 적 배경과 균주의 새끼는 비교할 수 없습니다. BALB/c 알비노 마우스에서 혈관은 VO 영역으로 빠르게 재성장하여 신생 혈관 술38이 크게 감소하여 연구에 약간의 어려움을 가져옵니다. C57BL/6 마우스에서, BALB/cJ 마우스 균주39,40과 비교할 때 광수용체 손상이 증가?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기술 지원에 대해 우리 실험실과 중산 안과 센터의 안과 동물 실험실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 또한 실험적 지원에 대해 Chunqiao Liu 교수에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC : 81670872; 중국 베이징), 중국 광둥성 자연과학재단(보조금 No.2019A1515011347), 중산 안과 센터 국가 안과학연구소의 고위급 병원 건설 프로젝트(보조금 No. 303020103; 광저우, 광동성, 중국).
Materials
| 1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
| 2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
| 48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
| Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
| Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
| DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
| Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
| Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
| Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
| Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
| Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
| Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
| O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
| Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
| Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
| SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
| Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
| Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
| Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
| Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
| ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |
References
- Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 – Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
- Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), 7-17 (1957).
- Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
- Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473 (2018).
- Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
- Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O’Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
- Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
- Fielder, A., Blencowe, H., O’Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
- Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 69-73 (2006).
- Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
- Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
- Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
- Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
- Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748 (2008).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241 (2017).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
- Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
- Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
- McLeod, D. S., D’Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
- Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
- Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
- Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
- Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
- Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
- Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
- Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
