Surveillance de la croissance dynamique des vaisseaux rétiniens dans un modèle murin de rétinopathie induite par l’oxygène

Summary

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la préparation et la coloration par immunofluorescence de supports plats rétiniens de souris et l’analyse. L’utilisation de l’angiographie à la fluorescéine du fond d’œil (FFA) pour les petits de souris et le traitement d’images sont également décrits en détail.

Abstract

La rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) est largement utilisée pour étudier la croissance anormale des vaisseaux dans les maladies rétiniennes ischémiques, y compris la rétinopathie du prématuré (RDP), la rétinopathie diabétique proliférante (PDR) et l’occlusion veineuse rétinienne (OVR). La plupart des études OIR observent la néovascularisation rétinienne à des moments précis; cependant, la croissance dynamique des vaisseaux chez les souris vivantes le long d’un parcours temporel, ce qui est essentiel pour comprendre les maladies des vaisseaux liées à l’OIR, a été sous-étudiée. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour l’induction du modèle murin OIR, en soulignant les pièges potentiels et en fournissant une méthode améliorée pour quantifier rapidement les zones de vaso-oblitération (VO) et de néovascularisation (NV) en utilisant la coloration par immunofluorescence. Plus important encore, nous avons surveillé la repousse des vaisseaux chez des souris vivantes de P15 à P25 en effectuant une angiographie du fond d’œil à la fluorescéine (FFA) dans le modèle murin OIR. L’application de FFA au modèle murin OIR nous permet d’observer le processus de remodelage pendant la repousse des vaisseaux.

Introduction

La néovascularisation rétinienne (RNV), qui est définie comme un état où de nouveaux vaisseaux pathologiques proviennent des veines rétiniennes existantes, s’étend généralement le long de la surface interne de la rétine et se développe dans l’espace vitré (ou sous-rétinien dans certaines conditions)¹. C’est une caractéristique caractéristique et une caractéristique commune de nombreuses rétinopathies ischémiques, y compris la rétinopathie du prématuré (RDP), l’occlusion veineuse rétinienne (OVR) et la rétinopathie diabétique proliférative (PDR)².

De nombreuses observations cliniques et expérimentales ont indiqué que l’ischémie est la principale cause de néovascularisation rétinienne ^3,4. Dans la RDP, les nouveau-nés sont exposés à un niveau élevé d’oxygène dans des incubateurs fermés pour augmenter les taux de survie, ce qui est également un facteur important pour l’arrêt de la croissance vasculaire. Une fois le traitement terminé, les rétines des nouveau-nés connaissent une période relativement hypoxique⁵. D’autres situations sont observées dans l’occlusion des veines rétiniennes centrales ou branchées dans la RVO et des lésions des capillaires rétiniens sont également observées, causées par la microangiopathie dans PDR². L’hypoxie augmente encore l’expression de facteurs angiogéniques tels que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) par la voie de signalisation du facteur 1α induit par l’hypoxie (HIF-1α) qui, à son tour, guide les cellules endothéliales vasculaires pour se développer dans la zone hypoxique et former de nouveaux vaisseaux ^6,7.

La RDP est une sorte de rétinopathie proliférative vasculaire chez les nouveau-nés prématurés et l’une des principales causes de cécité infantile ^8,9, caractérisée par une hypoxie rétinienne, une néovascularisation rétinienne et une hyperplasie fibreuse^10,11,12. Dans les années 1950, les chercheurs ont découvert qu’une concentration élevée d’oxygène peut améliorer considérablement les symptômes respiratoires des prématurés^13,14. En conséquence, l’oxygénothérapie était de plus en plus utilisée chez les prématurés à cette époque¹⁵. Cependant, parallèlement à l’utilisation généralisée de l’oxygénothérapie chez les nouveau-nés prématurés, l’incidence de la RDP augmentait d’année en année. Depuis lors, les chercheurs ont lié l’oxygène à la RDP, explorant divers modèles animaux pour comprendre la pathogenèse de la ROP et de la RNV¹⁶.

Chez l’homme, la majeure partie du développement vasculaire rétinien est achevée avant la naissance, tandis que chez les rongeurs, le système vasculaire rétinien se développe après la naissance, fournissant un système modèle accessible pour étudier l’angiogenèse dans le système vasculaire rétinien². Avec les progrès continus de la recherche, les modèles de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR) sont devenus des modèles majeurs pour imiter l’angiogenèse pathologique résultant de l’ischémie. Il n’y a pas d’espèce animale spécifique dans l’étude du modèle OIR et le modèle a été développé chez diverses espèces animales, y compris chaton 17, rat^{18, souris 19}, beagle puppy 20 et poisson zèbre ²¹. Tous les modèles partagent le même mécanisme par lequel ils sont exposés à l’hyperoxie au début du développement rétinien, puis retournés dans l’environnement normoxique. Smith et al. ont observé que l’exposition des bébés souris à l’hyperoxie de P7 pendant 5 jours induisait une forme extrême de régression des vaisseaux dans la rétine centrale et les ramener à l’air ambiant à P12 déclenchait progressivement des touffes néovasculaires, qui se sont développées vers le corps vitré¹⁹. Il s’agissait d’un modèle de souris OIR standardisé également nommé modèle Smith. Connor et al. ont encore optimisé le protocole et fourni une méthode universellement applicable pour quantifier la zone de VO (vaso-oblitération) et NV (néovascularisation) en 2009, ce qui a augmenté l’acceptation et l’utilisation du modèle²². Le modèle murin OIR est toujours le modèle le plus largement utilisé aujourd’hui en raison de sa petite taille, de sa reproduction rapide, de son bagage génétique clair, de sa bonne répétabilité et de son taux de réussite élevé.

Chez la souris, la vascularisation rétinienne commence après la naissance avec la croissance des vaisseaux de la tête du nerf optique dans la rétine interne vers l’ora serrata. Au cours du développement rétinien normal, les premiers vaisseaux rétiniens jaillissent de la tête du nerf optique autour de la naissance, formant un réseau en expansion (le plexus primaire) qui atteint la périphérie vers le jour postnatal 7 (P7) ²³. Ensuite, les vaisseaux commencent à se développer dans la rétine pour former une couche profonde, pénétrer dans la rétine et établir un réseau laminaire autour de la couche nucléaire interne (INL) comme chez l’homme²⁴. À la fin de la troisième semaine postnatale (P21), le développement plus profond du plexus est presque terminé. Pour le modèle murin OIR, l’occlusion vasculaire apparaît toujours dans la rétine centrale en raison de la dégénérescence rapide d’un grand nombre de réseaux vasculaires immatures dans la région centrale lors de l’exposition à l’hyperoxie. Ainsi, la croissance de la néovascularisation pathologique se produit également dans la rétine périphérique moyenne, qui est la limite de la zone de non-perfusion et de la zone vasculaire. Cependant, les vaisseaux rétiniens humains se sont presque formés avant la naissance. Comme pour les prématurés, la rétine périphérique n’est pas complètement vascularisée lorsqu’elle est exposée à l’hyperoxie^25,26. Ainsi, l’occlusion vasculaire et la néovascularisation apparaissent principalement dans la rétine périphérique^27,28. Malgré ces différences, le modèle OIR murin récapitule étroitement les événements pathologiques qui se produisent lors de la néovascularisation induite par l’ischémie.

L’induction du modèle OIR peut être divisée en deux phases²⁹ : en phase 1 (phase hyperoxie), le développement vasculaire rétinien est arrêté ou retardé avec occlusion et régression des vaisseaux sanguins à la suite du déclin du VEGF et de l’apoptose des cellules endothéliales ^24,30 ; En phase 2 (phase hypoxie), l’apport rétinien en oxygène deviendra insuffisant dans les conditions de l’air ambiant²⁹, ce qui est essentiel pour le développement neuronal et l’homéostasie ^19,31. Cette situation ischémique entraîne généralement une néovascularisation anormale non régulée.

Actuellement, la méthode de modélisation couramment utilisée est l’alternance d’une exposition élevée / faible à l’oxygène: les mères et leurs petits sont exposés à 75% d’oxygène pendant 5 jours à P7, suivis de 5 jours dans l’air ambiant jusqu’à ce que P17 ait démontré des résultats comparables²², qui est le critère d’évaluation de l’induction du modèle murin OIR. (Figure 1). En plus de simuler la RDP, cette néovascularisation pathologique médiée par l’ischémie peut également être utilisée pour étudier d’autres maladies ischémiques de la rétine. Les principales mesures de ce modèle comprennent la quantification de la zone de VO et NV, qui sont analysées à partir de supports plats rétiniens par coloration par immunofluorescence ou perfusion FITC-dextrane. Chaque souris ne peut être étudiée qu’une seule fois en raison de l’opération létale. À l’heure actuelle, il existe peu de méthodes pour observer les changements dynamiques du système vasculaire rétinien en continu au cours du processus de régression vasculaire et d’angiogenèse pathologique³². Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé d’induction du modèle OIR, l’analyse des montures plates rétiniennes ainsi qu’un flux de travail d’angiographie du fond d’œil à la fluorescéine (FFA) sur des souris, ce qui serait utile pour acquérir une compréhension plus complète des changements dynamiques vasculaires au cours des deux phases du modèle murin OIR.

Protocol

Toutes les procédures impliquant l’utilisation de souris ont été approuvées par le comité d’éthique expérimentale animale du Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, Chine (numéro autorisé: 2020-082), et conformément aux directives approuvées du Comité de soin et d’utilisation des animaux du Zhongshan Ophthalmic Center et de la Déclaration de l’Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. <p class="…

Representative Results

Dans le modèle murin OIR, le résultat le plus important et le plus fondamental est la quantification de la zone VO et NV. Après avoir vécu dans l’environnement hyperoxique pendant 5 jours à partir de P7, la rétine centrale des chiots a montré la plus grande zone de non-perfusion. Sous la stimulation de l’hypoxie dans 5 jours supplémentaires, une néovascularisation rétinienne a été progressivement produite qui a fluorescé plus intensément que les vaisseaux normaux environnants. Après P17, le signal de f…

Discussion

La sensibilité des souris à l’OIR est affectée par de nombreux facteurs. Les petits de différents antécédents génétiques et souches ne peuvent pas être comparés. Chez les souris albinos BALB/c, les vaisseaux repoussent rapidement dans la zone VO avec une réduction significative des touffes néovasculaires³⁸, ce qui entraîne certaines difficultés pour la recherche. Chez les souris C57BL/6, les lésions photorécepteurs sont accrues par rapport à la souche^{39,40</sup…}

Materials

1 mL sterile syringe	Solarbio	YA0550	For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01	For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube	Corning	MCT-200-C	For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3548	For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides	Various		For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		For image analysis
Carbon dioxide gas	Various		For sacrifice
Cover slide	Various		For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps	World Precision Instruments	14127	For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution	Abcam	ab228549	For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope	Olmpus	SZ61	For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium	Sigma-Aldrich	F6377	For in vivo imaging
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2	For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01	For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose	Maya	89161	For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody	Invitrogen	I21413	For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J	GemPharmatech of Jiangsu Province		For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242	For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6	For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum	Abcam	ab7475	For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor	Various		For monitoring the level of O2
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148-1KG	For tissue fixation
Pentobarbital sodium	Various		For anesthesia
Soda lime	Various		For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0	IBM		For statistical analysis
Tansference decloring shaker	Kylin-Bell	ZD-2008	For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment)	Corning	3261-20EA	For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes	Various		For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818	For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide	Various		For in vivo imaging
ZEN Imaging Software	ZEISS		For image acquisition and export