酸素誘発網膜症マウスモデルにおける網膜血管の動的成長のモニタリング
Summary
このプロトコルは、マウス網膜フラットマウントの調製および免疫蛍光染色および分析のための詳細な方法を記載する。マウスの仔に対するフルオレセイン眼底造影(FFA)の使用および画像処理についても詳細に説明されている。
Abstract
酸素誘発網膜症(OIR)は、未熟児網膜症(ROP)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、網膜静脈閉塞症(RVO)などの虚血性網膜疾患における異常な血管成長の研究に広く使用されています。ほとんどのOIR研究は、特定の時点で網膜新生血管を観察します。しかし、生きたマウスの時間経過に沿った動的な血管成長は、OIR関連血管疾患の理解に不可欠であり、研究が進められてきました。ここでは、OIRマウスモデルの誘導のための段階的なプロトコルについて説明し、潜在的な落とし穴を強調し、免疫蛍光染色を使用して血管閉塞(VO)および新生血管(NV)の領域を迅速に定量するための改善された方法を提供します。さらに重要なことに、OIRマウスモデルでフルオレセイン眼底造影(FFA)を行うことにより、生きたマウスのP15からP25までの血管再成長を監視しました。OIRマウスモデルにFFAを適用することで、血管再成長中のリモデリング過程を観察することができます。
Introduction
網膜新生血管(RNV)は、既存の網膜静脈から新しい病理学的血管が始まり、通常、網膜の内面に沿って伸び、硝子体(または場合によっては網膜下腔)に成長する状態として定義されます1。これは、未熟児網膜症(ROP)、網膜静脈閉塞症(RVO)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)2など、多くの虚血性網膜症の特徴であり、共通の特徴です。
多くの臨床的および実験的観察は、虚血が網膜新生血管形成の主な原因であることを示しています3,4。ROPでは、新生児は密閉型インキュベーター内で高レベルの酸素にさらされて生存率を高め、これも血管の成長を停止させる重要な推進力です。治療が行われた後、新生児の網膜は比較的低酸素期間5を経験します。RVOの網膜中心静脈または分枝静脈の閉塞に他の状況が見られ、PDR2の細小血管症によって引き起こされる網膜毛細血管の損傷も観察されます。低酸素症はさらに、低酸素誘導因子-1α(HIF-1α)シグナル伝達経路を介して血管内皮増殖因子(VEGF)などの血管新生因子の発現を増加させ、血管内皮細胞を低酸素領域に成長させ、新しい血管を形成するように導きます6,7。
ROPは、早産児の血管増殖性網膜症の一種であり、小児失明の主な原因8,9であり、網膜低酸素症、網膜新生血管、線維性過形成を特徴とする10,11,12。1950年代に、研究者は高濃度の酸素が未熟児の呼吸器症状を大幅に改善できることを発見しました13,14。その結果、酸素療法は当時の未熟児にますます使用されていました15。しかし、早産児における酸素療法の普及と同時に、ROPの発生率は年々増加した。それ以来、研究者は酸素をROPに関連付け、ROPとRNV16の病因を理解するためにさまざまな動物モデルを探索してきました。
ヒトでは、ほとんどの網膜血管系の発達は出生前に完了しますが、げっ歯類では網膜血管系は出生後に発達し、網膜血管系の血管新生を研究するためのアクセス可能なモデルシステムを提供します2。研究の継続的な進歩に伴い、酸素誘発網膜症(OIR)モデルは、虚血に起因する病理学的血管新生を模倣するための主要なモデルになりました。OIRモデルの研究には特定の動物種はなく、子猫17、ラット18、マウス19、ビーグル子犬20、ゼブラフィッシュ21など、さまざまな動物種でモデルが開発されています。すべてのモデルは、初期の網膜発達中に高酸素症にさらされ、その後正常酸素環境に戻るという同じメカニズムを共有しています。Smithらは、マウスの子犬をP7からの高酸素症に5日間さらすと、網膜中心に極端な形態の血管退行が誘発され、P12の室内空気に戻すと、徐々に血管新生房が引き起こされ、硝子体に向かって成長することを観察しました19。これは、スミスモデルとも呼ばれる標準化されたOIRマウスモデルでした。Connorらはプロトコルをさらに最適化し、2009年にVO(血管閉塞)とNV(血管新生)の面積を定量化するための普遍的に適用可能な方法を提供し、モデル22の受け入れと利用を増やしました。OIRマウスモデルは、サイズが小さく、繁殖が速く、遺伝的背景が明確で、再現性が高く、成功率が高いため、現在でも最も広く使用されているモデルです。
マウスでは、網膜血管新生は出生後に視神経頭から内網膜に向かって大口鋸歯状突起に向かって血管が内向きに成長することから始まります。正常な網膜の発達中、最初の網膜血管は出生前後に視神経乳頭から発芽し、生後7日目頃に末梢に到達する拡大ネットワーク(一次神経叢)を形成します(P7)23。その後、血管は網膜に成長し始めて深層を形成し、網膜を貫通し、ヒト24のように内顆粒層(INL)の周りに層流ネットワークを確立します。生後3週目(P21)の終わりまでに、より深い神経叢の発達はほぼ完了します。OIRマウスモデルでは、高酸素曝露中に中央領域の多数の未熟な血管網が急速に変性するため、血管閉塞は常に中央網膜に現れます。したがって、病理学的新生血管の成長は、非灌流領域と血管領域の境界である中末梢網膜でも発生します。しかし、人間の網膜血管は出生前にほとんど形成されています。未熟児に関しては、末梢網膜は高酸素症にさらされたときに完全に血管新生していません25,26。そのため血管閉塞や血管新生は主に末梢網膜27,28に現れる。これらの違いにもかかわらず、マウスOIRモデルは、虚血誘発性新生血管の間に起こる病理学的事象を厳密に再現する。
OIRモデルの誘導は、2つの相29に分けることができる:第1相(高酸素相)では、VEGFの低下および内皮細胞のアポトーシスの結果として、網膜血管の発達が血管の閉塞および退行によって停止または遅延される24,30;フェーズ2(低酸素フェーズ)では、神経発達と恒常性に不可欠な室内空気条件29の下で網膜酸素供給が不十分になります19,31。この虚血状態は通常、調節されていない異常な新生血管を引き起こします。
現在、一般的に使用されているモデリング方法は、高酸素/低酸素曝露を交互に行うことです:母親とその子犬は、P7で5日間75%酸素にさらされ、その後、P17が同等の結果を示すまで室内空気中で5日間曝露されます22、これはOIRマウスモデル誘導のエンドポイントです。(図1)。ROPのシミュレーションに加えて、この虚血媒介性病理学的新生血管は、他の虚血性網膜疾患の研究にも使用できます。このモデルの主な測定値には、免疫蛍光染色またはFITCデキストラン灌流によって網膜フラットマウントから分析されるVOおよびNVの面積の定量化が含まれます。各マウスは致命的な操作のために一度だけ研究することができます。現在、血管退縮および病理学的血管新生の過程で網膜血管系の動的変化を継続的に観察する方法はほとんどありません32。この論文では、OIRモデル誘導の詳細なプロトコル、網膜フラットマウントの分析、およびマウスでのフルオレセイン眼底血管造影(FFA)のワークフローを提供し、OIRマウスモデルの2つのフェーズ中の血管動態変化をより包括的に理解するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスのOIRに対する感受性は、多くの要因の影響を受けます。異なる遺伝的背景と系統の子犬を比較することはできません。BALB/cアルビノマウスでは、血管は血管新生房を大幅に減少させながらVO領域に急速に再成長し38、研究にいくつかの困難をもたらします。C57BL/6マウスでは、BALB/cJマウス系統39,40と比較して視体損傷が増加す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中山眼科センターの研究室と眼科動物研究所のすべてのメンバーの技術支援に感謝します。また、実験的支援をしてくださった劉春橋教授にも感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC:81670872;中国北京)、中国広東省自然科学財団(助成金番号2019A1515011347)、および中山眼科センターの眼科国家重点研究所からの高レベル病院建設プロジェクト(助成金番号303020103;広州、広東省、中国)。
Materials
| 1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
| 2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
| 48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
| Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
| Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
| DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
| Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
| Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
| Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
| Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
| Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
| Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
| O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
| Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
| Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
| SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
| Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
| Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
| Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
| Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
| ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |
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