Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.
La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se usa ampliamente para estudiar el crecimiento anormal de vasos en enfermedades isquémicas de la retina, incluida la retinopatía del prematuro (ROP), la retinopatía diabética proliferativa (PDR) y la oclusión de la vena retiniana (RVO). La mayoría de los estudios OIR observan neovascularización retiniana en puntos de tiempo específicos; sin embargo, el crecimiento dinámico de vasos en ratones vivos a lo largo de un curso de tiempo, que es esencial para comprender las enfermedades vasculares relacionadas con OIR, ha sido poco estudiado. Aquí, describimos un protocolo paso a paso para la inducción del modelo de ratón OIR, destacando las posibles dificultades y proporcionando un método mejorado para cuantificar rápidamente las áreas de vaso-obliteración (VO) y neovascularización (NV) utilizando tinción de inmunofluorescencia. Más importante aún, monitoreamos el recrecimiento de los vasos en ratones vivos de P15 a P25 mediante la realización de angiografía de fondo de ojo fluoresceína (FFA) en el modelo de ratón OIR. La aplicación de FFA al modelo de ratón OIR nos permite observar el proceso de remodelación durante el recrecimiento del vaso.
La neovascularización retiniana (RNV), que se define como un estado en el que nuevos vasos patológicos se originan en las venas retinianas existentes, generalmente se extiende a lo largo de la superficie interna de la retina y crece en el espacio vítreo (o subretiniano en algunas condiciones)1. Es un sello distintivo y una característica común de muchas retinopatías isquémicas, incluyendo la retinopatía del prematuro (ROP), la oclusión de la vena retiniana (RVO) y la retinopatía diabética proliferativa (RDP)2.
Numerosas observaciones clínicas y experimentales han indicado que la isquemia es la principal causa de neovascularización retiniana 3,4. En la ROP, los neonatos están expuestos a oxígeno de alto nivel en incubadoras cerradas para aumentar las tasas de supervivencia, lo que también es un factor importante para la detención del crecimiento vascular. Después del tratamiento, las retinas de los recién nacidos experimentan un período relativamente hipóxico5. Otras situaciones se observan en la oclusión de las venas retinianas centrales o ramificadas en la OVR y también se observa daño de los capilares retinianos causado por microangiopatía en la PDR2. La hipoxia aumenta aún más la expresión de factores angiogénicos como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a través de la vía de señalización del factor 1α inducido por hipoxia (HIF-1α) que a su vez guía a las células endoteliales vasculares para crecer en el área hipóxica y formar nuevos vasos 6,7.
La RP es un tipo de retinopatía proliferativa vascular en lactantes prematuros y una de las principales causas de ceguera infantil 8,9, que se caracteriza por hipoxia retiniana, neovascularización retiniana e hiperplasia fibrosa10,11,12. En la década de 1950, los investigadores encontraron que la alta concentración de oxígeno puede mejorar significativamente los síntomas respiratorios de los bebés prematuros13,14. Como resultado, la oxigenoterapia se usaba cada vez más en bebés prematuros en ese momento15. Sin embargo, simultáneamente con el uso generalizado de oxigenoterapia en lactantes prematuros, la incidencia de RP aumentó año tras año. Desde entonces, los investigadores han relacionado el oxígeno con la ROP, explorando varios modelos animales para comprender la patogénesis de la ROP y la RNV16.
En humanos, la mayor parte del desarrollo de la vasculatura retiniana se completa antes del nacimiento, mientras que en roedores la vasculatura retiniana se desarrolla después del nacimiento, proporcionando un sistema modelo accesible para estudiar la angiogénesis en la vasculatura retiniana2. Con el progreso continuo de la investigación, los modelos de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) se han convertido en modelos importantes para imitar la angiogénesis patológica resultante de la isquemia. No hay especies animales específicas en el estudio del modelo OIR y el modelo se ha desarrollado en varias especies animales, incluyendo gatito 17, rata18, ratón19, cachorro beagle 20 y pez cebra21. Todos los modelos comparten el mismo mecanismo por el cual están expuestos a la hiperoxia durante el desarrollo temprano de la retina y luego regresan al ambiente normóxico. Smith et al. observaron que la exposición de crías de ratón a la hiperoxia de P7 durante 5 días indujo una forma extrema de regresión de los vasos en la retina central y traerlas de vuelta al aire ambiente en P12 desencadenó gradualmente mechones neovasculares, que crecieron hacia el cuerpo vítreo19. Este fue un modelo de ratón OIR estandarizado también llamado modelo Smith. Connor et al. optimizaron aún más el protocolo y proporcionaron un método universalmente aplicable para cuantificar el área de VO (vaso-obliteración) y NV (neovascularización) en 2009, lo que aumentó la aceptación y utilización del modelo22. El modelo de ratón OIR sigue siendo el modelo más utilizado ahora debido a su pequeño tamaño, reproducción rápida, antecedentes genéticos claros, buena repetibilidad y alta tasa de éxito.
En ratones, la vascularización retiniana comienza después del nacimiento con el crecimiento interno de vasos desde la cabeza del nervio óptico hacia la retina interna hacia la ora serrata. Durante el desarrollo normal de la retina, los primeros vasos retinianos brotan de la cabeza del nervio óptico alrededor del nacimiento, formando una red en expansión (el plexo primario) que llega a la periferia alrededor del día postnatal 7 (P7) 23. Luego, los vasos comienzan a crecer en la retina para formar una capa profunda, penetrar en la retina y establecer una red laminar alrededor de la capa nuclear interna (INL) como en el humano24. Al final de la tercera semana postnatal (P21), el desarrollo más profundo del plexo está casi completo. Para el modelo de ratón OIR, la oclusión vascular siempre aparece en la retina central debido a la rápida degeneración de un gran número de redes vasculares inmaduras en la región central durante la exposición a la hiperoxia. Por lo tanto, el crecimiento de la neovascularización patológica también ocurre en la retina periférica media, que es el límite del área de no perfusión y el área vascular. Sin embargo, los vasos retinianos humanos casi se han formado antes del nacimiento. En cuanto a los bebés prematuros, la retina periférica no está completamente vascularizada cuando se expone a la hiperoxia25,26. Así, la oclusión vascular y la neovascularización aparecen principalmente en la retina periférica27,28. A pesar de estas diferencias, el modelo OIR de ratón recapitula de cerca los eventos patológicos que ocurren durante la neovascularización inducida por isquemia.
La inducción del modelo OIR se puede dividir en dos fases29: en la fase 1 (fase de hiperoxia), el desarrollo vascular retiniano se detiene o retrasa con oclusión y regresión de los vasos sanguíneos como resultado de la disminución del VEGF y la apoptosis de las células endoteliales 24,30; En la fase 2 (fase de hipoxia), el suministro de oxígeno retiniano será insuficiente en condiciones de aire ambiente29, lo cual es esencial para el desarrollo neural y la homeostasis 19,31. Esta situación isquémica generalmente resulta en una neovascularización anormal no regulada.
Actualmente, el método de modelado comúnmente utilizado es alternar la exposición alta / baja al oxígeno: las madres y sus cachorros están expuestos al 75% de oxígeno durante 5 días en P7 seguido de 5 días en el aire ambiente hasta que P17 demostró resultados comparables22, que es el punto final de la inducción del modelo de ratón OIR. (Figura 1). Además de simular la ROP, esta neovascularización patológica mediada por isquemia también se puede utilizar para estudiar otras enfermedades isquémicas de la retina. Las principales mediciones de este modelo incluyen la cuantificación del área de VO y NV, que se analizan a partir de montajes planos retinianos mediante tinción de inmunofluorescencia o perfusión FITC-dextrano. Cada ratón puede ser estudiado sólo una vez debido a la operación letal. En la actualidad, existen pocos métodos para observar continuamente cambios dinámicos de la vasculatura retiniana durante el proceso de regresión vascular y angiogénesis patológica32. En este documento, proporcionamos un protocolo detallado de inducción del modelo OIR, análisis de montajes planos retinianos, así como un flujo de trabajo de angiografía de fondo de ojo fluoresceína (FFA) en ratones que sería útil para obtener una comprensión más completa de los cambios dinámicos vasculares durante dos fases del modelo de ratón OIR.
La susceptibilidad de los ratones a OIR se ve afectada por muchos factores. Los cachorros de diferentes antecedentes genéticos y cepas no se pueden comparar. En ratones albinos BALB/c, los vasos vuelven a crecer rápidamente en el área de VO con mechones neovasculares significativamente reducidos38, lo que trae algunas dificultades a la investigación. En ratones C57BL/6, hay un aumento del daño a los fotorreceptores en comparación con la cepa de ratón BALB/cJ39,40<sup…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a todos los miembros de nuestro laboratorio y del Laboratorio de Animales Oftálmicos del Centro Oftalmológico Zhongshan por su asistencia técnica. También agradecemos al Prof. Chunqiao Liu por su apoyo experimental. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC: 81670872; Beijing, China), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (Subvención No.2019A1515011347), y el proyecto de construcción de hospitales de alto nivel del Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología en el Centro Oftalmológico Zhongshan (Subvención No. 303020103; Guangzhou, provincia de Guangdong, China).
1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |