ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.
Abstract
רטינופתיה הנגרמת על-ידי חמצן (OIR) נמצאת בשימוש נרחב לחקר צמיחת כלי דם חריגה במחלות רשתית איסכמיות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתרבה (PDR) וחסימת ורידים ברשתית (RVO). רוב מחקרי OIR מתבוננים בניאו-וסקולריזציה של הרשתית בנקודות זמן ספציפיות; עם זאת, הצמיחה הדינמית של כלי שיט בעכברים חיים לאורך מסלול זמן, החיונית להבנת מחלות כלי הדם הקשורות ל-OIR, לא נחקרה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב להשראת מודל עכבר OIR, המדגיש את המלכודות הפוטנציאליות, ומספק שיטה משופרת לכימות מהיר של אזורים של מחיקת כלי דם (VO) וניאו-וסקולריזציה (NV) באמצעות צביעת אימונופלואורסצנציה. חשוב מכך, עקבנו אחר צמיחה מחדש של כלי דם בעכברים חיים מ-P15 עד P25 על-ידי ביצוע אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) במודל עכבר OIR. היישום של FFA למודל העכבר OIR מאפשר לנו לבחון את תהליך השיפוץ במהלך צמיחה מחדש של כלי שיט.
Introduction
ניאו-וסקולריזציה של הרשתית (RNV), המוגדרת כמצב שבו כלי דם פתולוגיים חדשים מקורם בוורידים קיימים ברשתית, משתרעת בדרך כלל לאורך המשטח הפנימי של הרשתית וגדלה לתוך הזגוגית (או החלל התת-קרקעי בתנאים מסוימים)1. זהו סימן היכר ומאפיין נפוץ של רטינופתיות איסכמיות רבות, כולל רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית (RVO) ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR)2.
תצפיות קליניות וניסיוניות רבות הצביעו על כך שאיסכמיה היא הגורם העיקרי לניאו-וסקולריזציה של הרשתית 3,4. ב- ROP, ילודים נחשפים לחמצן ברמה גבוהה באינקובטורים סגורים כדי להגדיל את שיעורי ההישרדות, שהוא גם מניע חשוב לעצירת צמיחת כלי הדם. לאחר סיום הטיפול, הרשתיות של תינוקות חווים תקופה היפוקסית יחסית5. מצבים אחרים נראים בחסימה של ורידים ברשתית מרכזית או מסועפת ב- RVO ונזק של נימי הרשתית נצפה גם אשר נגרמת על ידי מיקרואנגיופתיה ב PDR2. היפוקסיה מגבירה עוד יותר את הביטוי של גורמים אנגיוגניים כגון גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) דרך מסלול האיתות המושרה על ידי היפוקסיה-1α (HIF-1α) אשר בתורו מנחה את תאי אנדותל כלי הדם לגדול לתוך האזור ההיפוקסי וליצור כלי דם חדשים 6,7.
ROP הוא סוג של רטינופתיה שגשוגית וסקולרית בפגים וגורם מוביל לעיוורון ילדות8,9, המאופיין בהיפוקסיה ברשתית, ניאו-וסקולריזציה של הרשתית והיפרפלזיה סיבית10,11,12. בשנות ה-50 של המאה ה-20, חוקרים מצאו כי ריכוז גבוה של חמצן יכול לשפר באופן משמעותי את התסמינים הנשימתיים של פגים13,14. כתוצאה מכך, טיפול בחמצן היה בשימוש הולך וגובר בפגים באותה תקופה15. עם זאת, במקביל לשימוש הנרחב בטיפול בחמצן בפגים, שכיחות ה-ROP עלתה משנה לשנה. מאז, חוקרים קישרו חמצן ל-ROP, וחקרו מודלים שונים של בעלי חיים כדי להבין את הפתוגנזה של ROP ו-RNV16.
באדם, רוב התפתחות כלי הדם ברשתית מסתיימת לפני הלידה ואילו במכרסמים כלי הדם ברשתית מתפתחים לאחר הלידה, ומספקים מערכת מודל נגישה לחקר אנגיוגנזה בכלי הדם ברשתית2. עם ההתקדמות המתמשכת של המחקר, מודלים של רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) הפכו למודלים מרכזיים לחיקוי אנגיוגנזה פתולוגית הנובעת מאיסכמיה. אין מיני בעלי חיים ספציפיים במחקר של מודל OIR והמודל פותח במיני בעלי חיים שונים, כולל חתלתול 17, חולדה18, עכבר19, גור ביגל 20 ודג זברה21. כל המודלים חולקים את אותו מנגנון שבאמצעותו הם נחשפים להיפראוקסיה במהלך התפתחות הרשתית המוקדמת ולאחר מכן מוחזרים לסביבה הנורמוקסית. סמית’ ואחרים הבחינו בכך שחשיפת גורי עכברים להיפרוקסיה מ-P7 במשך 5 ימים גרמה לצורה קיצונית של רגרסיה של כלי הדם ברשתית המרכזית והחזרתם לאוויר החדר ב-P12 עוררה בהדרגה ציצים ניאו-וסקולריים, שגדלו לכיוון הגוף הזגוגי19. זה היה דגם עכבר OIR סטנדרטי שנקרא גם כמודל סמית’. Connor et al. המשיכו לייעל את הפרוטוקול וסיפקו שיטה ישימה אוניברסלית לכימות האזור של VO (מחיקה של vaso) ו- NV (neovascularization) בשנת 2009, מה שהגדיל את הקבלה והניצול של מודל22. מודל עכבר OIR הוא עדיין המודל הנפוץ ביותר כיום בגלל גודלו הקטן, רבייה מהירה, רקע גנטי ברור, יכולת חזרה טובה ושיעור הצלחה גבוה.
בעכברים, כלי הדם ברשתית מתחילים לאחר הלידה עם צמיחה של כלי דם מראש עצב הראייה לתוך הרשתית הפנימית לכיוון ora serrata. במהלך התפתחות רשתית תקינה, כלי הרשתית הראשונים נובטים מראש עצב הראייה סביב הלידה, ויוצרים רשת מתרחבת (מקלעת ראשונית) המגיעה לפריפריה סביב היום שלאחר הלידה 7(P7)23. לאחר מכן כלי הדם מתחילים לגדול לתוך הרשתית כדי ליצור שכבה עמוקה, לחדור את הרשתית, וליצור רשת למינרית סביב השכבה הגרעינית הפנימית (INL) כמו באדם24. בסוף השבוע השלישי שלאחר הלידה (P21), פיתוח מקלעת עמוקה יותר כמעט הושלם. עבור מודל עכבר OIR, חסימת כלי הדם מופיעה תמיד ברשתית המרכזית בגלל התנוונות מהירה של מספר רב של רשתות כלי דם לא בשלות באזור המרכז במהלך חשיפה להיפרוקסיה. לכן, הצמיחה של neovascularization פתולוגי מתרחשת גם ברשתית ההיקפית האמצעית, שהיא הגבול של האזור שאינו זלוף ואת אזור כלי הדם. עם זאת, כלי רשתית אנושיים כמעט נוצרו לפני הלידה. באשר לפגים, הרשתית ההיקפית אינה וסקולרית לחלוטין כאשר היא נחשפת להיפרוקסיה25,26. אז חסימת כלי דם וניאו-וסקולריזציה מופיעות בעיקר ברשתית ההיקפית27,28. למרות הבדלים אלה, מודל OIR העכבר משחזר מקרוב את האירועים הפתולוגיים המתרחשים במהלך ניאו-וסקולריזציה הנגרמת על ידי איסכמיה.
ניתן לחלק את האינדוקציה של מודל OIR לשני שלבים29: בשלב 1 (שלב היפרוקסיה), התפתחות כלי הדם ברשתית נעצרת או מפגרת עם חסימה ורגרסיה של כלי הדם כתוצאה מהירידה ב- VEGF והאפופטוזיס של תאי האנדותל 24,30; בשלב 2 (שלב ההיפוקסיה), אספקת החמצן ברשתית תהפוך לבלתי מספקת בתנאי אוויר בחדר29, החיוניים להתפתחות עצבית ולהומאוסטזיס 19,31. מצב איסכמי זה גורם בדרך כלל לניאו-וסקולריזציה לא מפוקחת ולא תקינה.
נכון לעכשיו, שיטת המידול הנפוצה היא חשיפה לחמצן גבוה/נמוך לסירוגין: אמהות והגורים שלהן נחשפים ל-75% חמצן במשך 5 ימים ב-P7 ולאחר מכן 5 ימים באוויר החדר עד ש-P17 הדגים תוצאות דומות22, שהיא נקודת הקצה של אינדוקציה של מודל עכבר OIR. (איור 1). בנוסף להדמיית ROP, זה neovascularization פתולוגי בתיווך איסכמיה יכול לשמש גם כדי לחקור מחלות רשתית איסכמיות אחרות. המדידות העיקריות של מודל זה כוללות כימות השטח של VO ו- NV, אשר מנותחים מתוך תושבות שטוחות רשתית על ידי צביעת אימונופלואורסצנציה או זלוף FITC-dextran. כל עכבר יכול להיחקר רק פעם אחת בגלל הפעולה הקטלנית. כיום, ישנן כמה שיטות לבחון שינויים דינמיים של כלי הדם ברשתית ברציפות במהלך תהליך של רגרסיה וסקולרית ואנגיוגנזה פתולוגית32. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של אינדוקציה של מודל OIR, ניתוח של תושבות שטוחות ברשתית, כמו גם זרימת עבודה של אנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) על עכברים אשר יהיה מועיל להשיג הבנה מקיפה יותר של שינויים דינמיים של כלי הדם במהלך שני שלבים של מודל עכבר OIR.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרגישות של עכברים ל- OIR מושפעת מגורמים רבים. לא ניתן להשוות בין גורים בעלי רקע גנטי וזנים שונים. בעכברי לבקנים BALB/c, כלי הדם צומחים מחדש לאזור ה-VO במהירות עם הפחתה משמעותית של ציצים ניאו-וסקולריים38, מה שמביא כמה קשיים למחקר. בעכברי C57BL/6 יש נזק מוגבר לפוטורצפטור בהשוואה לזן עכבר BALB…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל החברים מהמעבדה שלנו וממעבדת בעלי החיים של Zhongshan Ophthalmic Center על הסיוע הטכני שלהם. אנו מודים גם לפרופ’ צ’ונקיאו ליו על התמיכה הניסיונית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC: 81670872; בייג’ינג, סין), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מענק מס ‘2019A1515011347), ופרויקט בניית בית חולים ברמה גבוהה ממעבדת מפתח המדינה לרפואת עיניים במרכז העיניים ז’ונגשאן (מענק מס ‘303020103; גואנגג’ואו, מחוז גואנגדונג, סין).
Materials
| 1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
| 2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
| 48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
| Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
| Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
| DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
| Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
| Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
| Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
| Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
| Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
| Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
| O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
| OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
| Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
| Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
| SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
| SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
| Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
| Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
| Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
| Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
| ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |
References
- Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 – Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
- Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
- Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
- Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), 7-17 (1957).
- Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
- Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473 (2018).
- Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
- Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O’Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
- Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
- Fielder, A., Blencowe, H., O’Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
- Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 69-73 (2006).
- Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
- Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
- Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
- Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
- Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748 (2008).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241 (2017).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
- Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
- Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
- McLeod, D. S., D’Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
- Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
- Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
- Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
- Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
- Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
- Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
- Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
