Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för beredning och immunofluorescensfärgning av möss retinala platta fästen och analys. Användningen av fluorescein fundus angiografi (FFA) för mössungar och bildbehandling beskrivs också i detalj.
Syreinducerad retinopati (OIR) används ofta för att studera onormal kärltillväxt vid ischemiska retinala sjukdomar, inklusive retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) och retinal venocklusion (RVO). De flesta OIR-studier observerar retinal neovaskularisering vid specifika tidpunkter; den dynamiska kärltillväxten hos levande möss längs en tidskurs, som är avgörande för att förstå de OIR-relaterade kärlsjukdomarna, har dock understuderats. Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för induktion av OIR-musmodellen, belyser de potentiella fallgroparna och tillhandahåller en förbättrad metod för att snabbt kvantifiera områden med vaso-utplåning (VO) och neovaskularisering (NV) med hjälp av immunofluorescensfärgning. Ännu viktigare var att vi övervakade kärlåterväxten hos levande möss från P15 till P25 genom att utföra fluorescein fundus angiografi (FFA) i OIR-musmodellen. Tillämpningen av FFA på OIR-musmodellen gör att vi kan observera ombyggnadsprocessen under fartygsåterväxt.
Retinal neovaskularisering (RNV), som definieras som ett tillstånd där nya patologiska kärl härstammar från befintliga retinala vener, sträcker sig vanligtvis längs näthinnans inre yta och växer in i glaskroppen (eller subretinalt utrymme under vissa förhållanden)1. Det är ett kännetecken och vanligt inslag i många ischemiska retinopatier, inklusive retinopati av prematuritet (ROP), retinal venocklusion (RVO) och proliferativ diabetisk retinopati (PDR)2.
Många kliniska och experimentella observationer har visat att ischemi är den främsta orsaken till retinal neovaskularisering 3,4. I ROP utsätts nyfödda för syre på hög nivå i slutna inkubatorer för att öka överlevnadsgraden, vilket också är en viktig drivkraft för att stoppa vaskulär tillväxt. Efter att behandlingen är klar upplever näthinnorna hos nyfödda en relativt hypoxisk period5. Andra situationer ses vid ocklusion av centrala eller grena retinala vener i RVO och skador på retinala kapillärer observeras också vilket orsakas av mikroangiopati i PDR2. Hypoxi ökar ytterligare uttrycket av angiogena faktorer såsom vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) genom den hypoxiinducerade faktor-1α (HIF-1α) signalvägen som i sin tur leder vaskulära endotelceller att växa in i det hypoxiska området och bilda nya kärl 6,7.
ROP är en slags vaskulär proliferativ retinopati hos för tidigt födda barn och en ledande orsak till barnblindhet8,9, som kännetecknas av retinal hypoxi, retinal neovaskularisering och fibrös hyperplasi10,11,12. På 1950-talet fann forskare att hög koncentration av syre kan förbättra andningssymtomen hos för tidigt födda barn13,14 avsevärt. Som ett resultat användes syrebehandling alltmer hos för tidigt födda barn vid den tiden15. Men samtidigt med den utbredda användningen av syrebehandling hos för tidigt födda barn ökade förekomsten av ROP år för år. Sedan dess har forskare kopplat syre till ROP och utforskat olika djurmodeller för att förstå patogenesen av ROP och RNV16.
Hos människor är de flesta retinala vaskulaturutvecklingen avslutad före födseln medan retinal vaskulatur hos gnagare utvecklas efter födseln, vilket ger ett tillgängligt modellsystem för att studera angiogenes i retinal vaskulatur2. Med den kontinuerliga utvecklingen av forskningen har syreinducerad retinopati (OIR) -modeller blivit viktiga modeller för att efterlikna patologisk angiogenes till följd av ischemi. Det finns inga specifika djurarter i studien av OIR-modellen och modellen har utvecklats i olika djurarter, inklusive kattunge 17, råtta18, mus19, beaglevalp 20 och zebrafisk 21. Alla modeller delar samma mekanism genom vilken de utsätts för hyperoxi under tidig retinal utveckling och sedan återgår till den normoxiska miljön. observerade att exponering av musungar för hyperoxi från P7 i 5 dagar inducerade en extrem form av kärlregression i den centrala näthinnan och förde dem tillbaka till rumsluften vid P12 utlöste gradvis neovaskulära tufts, som växte mot glaskroppen19. Detta var en standardiserad OIR-musmodell som också heter Smith-modellen. optimerade ytterligare protokollet och tillhandahöll en universellt tillämplig metod för att kvantifiera området VO (vaso-utplåning) och NV (neovaskularisering) 2009, vilket ökade acceptansen och användningen av modellen22. OIR-musmodellen är fortfarande den mest använda modellen nu på grund av dess lilla storlek, snabba reproduktion, tydliga genetiska bakgrund, goda repeterbarhet och höga framgångsgrad.
Hos möss börjar retinal vaskularisering efter födseln med inväxt av kärl från synnervhuvudet till den inre näthinnan mot ora serrata. Under normal retinal utveckling spirar de första retinala kärlen från synnervhuvudet runt födseln och bildar ett expanderande nätverk (den primära plexusen) som når periferin runt postnatal dag 7 (P7) 23. Sedan börjar kärlen växa in i näthinnan för att bilda ett djupt lager, tränga in i näthinnan och etablera ett laminärt nätverk runt det inre kärnskiktet (INL) som i människa24. I slutet av den tredje postnatala veckan (P21) är djupare plexusutveckling nästan klar. För OIR-musmodellen uppträder vaskulär ocklusion alltid i den centrala näthinnan på grund av den snabba degenerationen av ett stort antal omogna vaskulära nätverk i den centrala regionen under hyperoxiexponering. Så tillväxten av patologisk neovaskularisering sker också i mitten av perifer näthinna, vilket är gränsen för icke-perfusionsområdet och kärlområdet. Emellertid har mänskliga retinala kärl nästan bildats före födseln. När det gäller för tidigt födda barn är den perifera näthinnan inte helt vaskulariserad när den utsätts för hyperoxi25,26. Så vaskulär ocklusion och neovaskularisering förekommer huvudsakligen i den perifera näthinnan27,28. Trots dessa skillnader rekapitulerar musens OIR-modell noggrant de patologiska händelserna som inträffar under ischemiinducerad neovaskularisering.
Induktionen av OIR-modellen kan delas in i två faser29: i fas 1 (hyperoxifas) arresteras eller fördröjs retinal vaskulär utveckling med ocklusion och regression av blodkärl som ett resultat av nedgången i VEGF och apoptosen av endotelceller 24,30; I fas 2 (hypoxifas) kommer retinal syretillförsel att bli otillräcklig under rumsluftförhållanden29, vilket är viktigt för neural utveckling och homeostas 19,31. Denna ischemiska situation resulterar vanligtvis i oreglerad, onormal neovaskularisering.
För närvarande är den vanliga modelleringsmetoden alternerande hög / låg syreexponering: Mödrar och deras valpar utsätts för 75% syre i 5 dagar vid P7 följt av 5 dagar i rumsluft tills P17 visade jämförbara resultat22, vilket är slutpunkten för OIR-musmodellinduktion. (Figur 1). Förutom att simulera ROP kan denna ischemimedierade patologiska neovaskularisering också användas för att studera andra ischemiska retinala sjukdomar. Huvudmätningarna av denna modell inkluderar kvantifiering av området för VO och NV, som analyseras från retinala platta fästen genom immunofluorescensfärgning eller FITC-dextranperfusion. Varje mus kan studeras endast en gång på grund av den dödliga operationen. För närvarande finns det få metoder för att observera dynamiska förändringar av retinal vaskulatur kontinuerligt under processen med vaskulär regression och patologisk angiogenes32. I detta dokument tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för OIR-modellinduktion, analys av retinala platta fästen samt ett arbetsflöde för fluorescein fundus angiografi (FFA) på möss som skulle vara till hjälp för att få en mer omfattande förståelse för vaskulära dynamiska förändringar under två faser av OIR-musmodellen.
Mössens mottaglighet för OIR påverkas av många faktorer. Valparna med olika genetisk bakgrund och stammar kan inte jämföras. Hos BALB/c albinomöss växer kärlen snabbt in i VO-området med signifikant reducerade neovaskulära tufts38, vilket medför vissa svårigheter för forskningen. Hos C57BL/6-möss finns det ökad fotoreceptorskada jämfört med BALB/cJ-musstam39,40. Detsamma gäller för olika typer av transgena möss<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla medlemmar från vårt laboratorium och oftalmiska djurlaboratorium i Zhongshan Ophthalmic Center för deras tekniska hjälp. Vi tackar också prof. Chunqiao Liu för experimentellt stöd. Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Peking, Kina), Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (bidrag nr 2019A1515011347) och sjukhusbyggnadsprojekt på hög nivå från State Key Laboratory of Ophthalmology vid Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, Guangdong-provinsen, Kina).
1 mL sterile syringe | Solarbio | YA0550 | For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection |
1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | For preparation of retinal flat mounts |
2 ml Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-200-C | For preparation of retinal flat mounts |
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Corning | 3548 | For preparation of retinal flat mounts |
Adhesive microscope slides | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Adobe Photoshop CC 2019 | Adobe Inc. | For image analysis | |
Carbon dioxide gas | Various | For sacrifice | |
Cover slide | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | For preparation of retinal flat mounts |
DAPI staining solution | Abcam | ab228549 | For labeling nucleus on retinal flat mounts |
Dissecting microscope | Olmpus | SZ61 | For preparation of retinal flat mounts |
Fluorescein sodium | Sigma-Aldrich | F6377 | For in vivo imaging |
Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts |
Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | For preparation of retinal flat mounts |
Hydroxypropyl Methylcellulose | Maya | 89161 | For in vivo imaging |
Isolectin B4 594 antibody | Invitrogen | I21413 | For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts |
Mice C57/BL6J | GemPharmatech of Jiangsu Province | For OIR model induction | |
Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | For preparation of retinal flat mounts |
No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | For preparation of retinal flat mounts |
Normal donkey serum | Abcam | ab7475 | For preparation of retinal flat mounts |
O2 sensor | Various | For monitoring the level of O2 | |
OxyCycler | Biospherix | A84XOV | For OIR model induction |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | For tissue fixation |
Pentobarbital sodium | Various | For anesthesia | |
Soda lime | Various | For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber | |
SPECTRALIS HRA+OCT | Heidelberg | HC00500002 | For in vivo imaging |
SPSS Statistics 22.0 | IBM | For statistical analysis | |
Tansference decloring shaker | Kylin-Bell | ZD-2008 | For preparation of retinal flat mounts |
Tissue culture dish (Low attachment) | Corning | 3261-20EA | For preparation of retinal flat mounts |
Transfer pipettes | Various | For preparation of retinal flat mounts | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 | For preparation of retinal flat mounts |
Tropicamide | Various | For in vivo imaging | |
ZEN Imaging Software | ZEISS | For image acquisition and export |