En Ex Vivo Brain Slice Model til at studere og målrette brystkræft hjernemetastatisk tumorvækst
Summary
Vi introducerer en protokol til måling af realtids lægemiddel- og strålingsrespons af brystkræft hjernemetastatiske celler i en organotypisk hjerneskivemodel. Metoderne giver et kvantitativt assay til at undersøge de terapeutiske virkninger af forskellige behandlinger på hjernemetastaser fra brystkræft på en ex vivo-måde inden for hjernens mikromiljøgrænseflade.
Abstract
Hjernemetastase er en alvorlig konsekvens af brystkræft for kvinder, da disse tumorer er vanskelige at behandle og er forbundet med dårlige kliniske resultater. Prækliniske musemodeller af brystkræft hjernemetastatisk (BCBM) vækst er nyttige, men er dyre, og det er svært at spore levende celler og tumorcelleinvasion i hjernens parenkym. Præsenteret her er en protokol for ex vivo hjerneskivekulturer fra xenograftede mus, der indeholder intrakranielt injicerede brystkræft hjernesøgende klonale underlinjer. MDA-MB-231BR luciferase mærkede celler blev injiceret intrakranielt i hjernen hos Nu/Nu hunmus, og efter tumordannelse blev hjernerne isoleret, skåret og dyrket ex vivo. Tumorskiverne blev afbildet for at identificere tumorceller, der udtrykker luciferase og overvåge deres spredning og invasion i hjerneparenchymen i op til 10 dage. Endvidere beskriver protokollen brugen af time-lapse-mikroskopi til at afbilde tumorcellernes vækst og invasive opførsel efter behandling med ioniserende stråling eller kemoterapi. Tumorcellernes reaktion på behandlinger kan visualiseres ved live-imaging mikroskopi, måling af bioluminescensintensitet og udførelse af histologi på hjerneskiven indeholdende BCBM-celler. Således kan denne ex vivo slice model være en nyttig platform til hurtig test af nye terapeutiske midler alene eller i kombination med stråling for at identificere lægemidler, der er tilpasset til at målrette mod en enkelt patients brystkræft hjernemetastatisk vækst i hjernens mikromiljø.
Introduction
Brystkræft hjernemetastaser (BCBM) udvikler sig, når celler spredes fra den primære brysttumor til hjernen. Brystkræft er den næsthyppigste årsag til hjernemetastase efter lungekræft, hvor metastaser forekommer hos 10-16% af patienterne1. Desværre forbliver hjernemetastaser uhelbredelige, da >80% af patienterne dør inden for et år efter deres hjernemetastasediagnose, og deres livskvalitet er nedsat på grund af neurologiske dysfunktioner2. Der er et presserende behov for at identificere mere effektive behandlingsmuligheder. Monolags todimensionelle eller tredimensionelle kulturmodeller er de mest almindeligt anvendte metoder til test af terapeutiske midler i laboratoriet. De efterligner imidlertid ikke det komplekse BCBM-mikromiljø, en vigtig drivkraft for tumorfænotype og vækst. Selvom disse modeller er nyttige, fanger de ikke de komplekse tumor-stromale interaktioner, de unikke metaboliske krav og heterogeniteten af tumorerne3. For mere trofast at rekapitulere tumor-stromale interaktioner og mikromiljøheterogenitet er vores gruppe og andre begyndt at generere organotypiske hjernemetastaser “skive” kulturer med patientafledte tumorceller (primære eller metastatiske) eller kræftcellelinjer 4,5,6. Sammenlignet med klassiske in vitro-systemer kan denne kortsigtede ex vivo-model give mere relevante betingelser for screening af nye lægemidler forud for præklinisk vurdering i kohorter af store dyr.
Ex vivo-modeller er blevet konstrueret og med succes anvendt primært til identifikation af vellykkede behandlinger af forskellige kræftformer. De kræver få dages vurdering og kan desuden skræddersys til patientspecifik lægemiddelscreening. For eksempel har human blære- og prostatakræft ex vivo-væv vist et dosisafhængigt antitumorrespons af docetaxel og gemcitabin7. Lignende kolorektal carcinom ex vivo væv blev udviklet til at screene kemoterapeutiske lægemidler Oxaliplatin, Cetuximab og Pembrolizumab8. Denne applikation er blevet anvendt i vid udstrækning i kræft i bugspytkirtlen, i betragtning af den væsentlige interaktion mellem stromalmiljøet og de genotypiske og fænotypiske egenskaber ved bugspytkirtel duktal adenocarcinom 9,10. Desuden er sådanne organotypiske modeller blevet udviklet til lignende screeninger i hoved-, nakke-, mave- og brysttumorer11,12.
Her genereres en ex vivo hjerneskivemodel af xenograftede brystkræft hjernemetastatiske tumorceller i deres mikromiljø. Mus blev intrakranielt injiceret med brystkræft hjerne metastatisk hjerne trofisk MDA-MB-231BR celler13 i hjernebarken parietal lobe – et almindeligt sted for TNBC metastase14,15 og fik lov til at udvikle tumorer. Hjerneskiver blev genereret fra disse xenograftede dyr og opretholdt ex vivo som organotypiske kulturer som beskrevet16,17. Denne nye ex vivo-model gør det muligt at analysere BCBM-cellens vækst i hjernens parenkym og kan bruges til at teste terapeutiske midler og strålingseffekter på tumorceller i hjernens mikromiljø.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse etablerer en ny ex vivo hjernekulturmetode til udplantede xenograft hjernetumorer. Vi viser, at BCBM-celler MDA-MB-231BR-celler intrakranielt injiceret i hjernen hos mus kan overleve og vokse i ex vivo-hjerneskiver . Undersøgelsen testede også intrakranielt injicerede U87MG glioblastom (GBM) celler og fandt også, at disse kræftceller overlever og vokser i hjerneskiver (data ikke vist). Vi mener, at denne model kan udvides ud over BCBM og GBM til andre kræftformer, der let metast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Julia Farnan, Kayla Green og Tiziana DeAngelis for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev delvist støttet af Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) og W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
