Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático do câncer de mama
Summary
Introduzimos um protocolo para medir a resposta de drogas e radiação em tempo real de células metastáticas cerebrais do câncer de mama em um modelo organotípico de fatia cerebral. Os métodos fornecem um ensaio quantitativo para investigar os efeitos terapêuticos de vários tratamentos em metástases cerebrais do câncer de mama de forma ex vivo dentro da interface de microambiente cerebral.
Abstract
A metástase cerebral é uma consequência séria do câncer de mama para as mulheres, pois esses tumores são difíceis de tratar e estão associados a desfechos clínicos ruins. Modelos pré-clínicos de camundongos do câncer de mama câncer de mama o crescimento metastático cerebral (BCBM) são úteis, mas são caros, e é difícil rastrear células vivas e invasão de células tumorais dentro do parnchyma cerebral. Apresentado aqui é um protocolo para culturas de fatias cerebrais ex vivo de camundongos xenoenxerados contendo sublines clonais intracranianas injetadas no cérebro do câncer de mama. Células etiquetadas de luciferase MDA-MB-231BR foram injetadas intracranianamente no cérebro de camundongos fêmeas Nu/Nu, e após a formação de tumores, os cérebros foram isolados, fatiados e cultivados ex vivo. As fatias tumorais foram imagens para identificar células tumorais expressando luciferase e monitorar sua proliferação e invasão no parênquim cerebral por até 10 dias. Além disso, o protocolo descreve o uso de microscopia de lapso de tempo para visualizar o crescimento e o comportamento invasivo das células tumorais após o tratamento com radiação ionizante ou quimioterapia. A resposta das células tumorais aos tratamentos pode ser visualizada por microscopia de imagem viva, medindo a intensidade da bioluminescência e realizando histologia na fatia cerebral contendo células BCBM. Assim, este modelo de fatia ex vivo pode ser uma plataforma útil para testes rápidos de novos agentes terapêuticos sozinhos ou em combinação com radiação para identificar drogas personalizadas para direcionar o crescimento metastático do cérebro do câncer de mama de uma paciente individual dentro do microambiente cerebral.
Introduction
As metástases cerebrais do câncer de mama (BCBM) se desenvolvem quando as células se espalham do tumor primário de mama para o cérebro. O câncer de mama é a segunda causa mais frequente de metástase cerebral após o câncer de pulmão, com metástases ocorrendo em 10-16% das pacientes1. Infelizmente, as metástases cerebrais permanecem incuráveis, pois >80% dos pacientes morrem dentro de um ano após o diagnóstico de metástase cerebral, e sua qualidade de vida é prejudicada devido a disfunções neurológicas2. É urgente identificar opções de tratamento mais eficazes. Modelos de cultura bidimensional ou tridimensional são os métodos mais utilizados para testar agentes terapêuticos em laboratório. No entanto, eles não imitam o complexo microambiente BCBM, um dos principais impulsionadores do fenótipo e crescimento tumoral. Embora esses modelos sejam úteis, eles não capturam as complexas interações tumorais-estromais, os requisitos metabólicos únicos e a heterogeneidade dos tumores3. Para recapitular mais fielmente as interações tumorais e a heterogeneidade do microambiente, nosso grupo e outros começaram a gerar culturas organotípicas de metástase cerebral “fatia” com células tumorais derivadas do paciente (primárias ou metastáticas) ou linhasde células cancerígenas 4,5,6. Comparado aos sistemas in vitro clássicos, este modelo ex vivo de curto prazo pode fornecer condições mais relevantes para a triagem de novas terapêuticas antes da avaliação pré-clínica em grandes coortes animais.
Modelos ex vivo foram construídos e utilizados com sucesso principalmente para a identificação de tratamentos bem-sucedidos de vários cânceres. Eles requerem poucos dias de avaliação e, além disso, podem ser adaptados para a triagem de medicamentos específico do paciente. Por exemplo, os tecidos ex vivo do câncer de bexiga e próstata têm mostrado uma resposta anti-tumor dependente de dose de docetaxel e gemcitabina7. Carcinoma colorretal ex vivo semelhantes foram desenvolvidos para tela quimioterapia oxaliplatina, Cetuximab e Pembrolizumab8. Esta aplicação tem sido amplamente utilizada no câncer de pâncreas, considerando a interação essencial entre o ambiente estromal e as características genotípicas e fenotípicas do adenocarcinoma ductal 9,10. Além disso, tais modelos organotípicos foram desenvolvidos para exames semelhantes em tumores de cabeça, pescoço, gástrico e mama11,12.
Aqui, um modelo de fatia cerebral ex vivo de células tumorais metastáticas do câncer de mama xenoenxerados em seu microambiente está sendo gerado. Camundongos foram intracranianamente injetados com câncer de mama cérebro tátático cérebro trófico células MDA-MB-231BR13 no lobo parietal córtex cerebral- um local comum de metástase TNBC 14,15 e permitido desenvolver tumores. Fatias cerebrais foram geradas a partir desses animais xenoengrafados e mantidas ex vivo como culturas organotípicas como descrito16,17. Este novo modelo ex vivo permite a análise do crescimento da célula BCBM dentro do parenchyma cerebral e pode ser usado para testar agentes terapêuticos e efeitos de radiação em células tumorais dentro do microambiente cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudo estabelece um novo método de cultura cerebral ex vivo para tumores cerebrais de xenoenxerto explantado. Mostramos que as células BCBM MDA-MB-231BR intracranianamente injetadas no cérebro de camundongos podem sobreviver e crescer em fatias cerebrais ex vivo . O estudo também testou células intracranianamente injetadas de glioblastoma U87MG (GBM) e também descobriu que essas células cancerígenas sobrevivem e crescem em fatias cerebrais (dados não mostrados). Acreditamos que esse model…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer julia Farnan, Kayla Green e Tiziana DeAngelis por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Programa de Subvenção universal de pesquisa da Pensilvânia (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA2227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) e W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
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