Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn
Summary
Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittel- und Strahlungsreaktion von metastasierenden Zellen des Brustkrebsgehirns in einem organotypischen Gehirnschnittmodell ein. Die Methoden bieten einen quantitativen Assay, um die therapeutischen Wirkungen verschiedener Behandlungen auf Hirnmetastasen von Brustkrebs in einer Ex-vivo-Weise innerhalb der Mikroumgebungsschnittstelle des Gehirns zu untersuchen.
Abstract
Hirnmetastasen sind eine schwerwiegende Folge von Brustkrebs bei Frauen, da diese Tumoren schwer zu behandeln sind und mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden sind. Präklinische Mausmodelle des mikrostatischen Wachstums des Brustkrebsgehirns (BCBM) sind nützlich, aber teuer, und es ist schwierig, lebende Zellen und die Invasion von Tumorzellen innerhalb des Gehirnparenchyms zu verfolgen. Hier wird ein Protokoll für Ex-vivo-Hirnschnittkulturen von xenotransplantierten Mäusen vorgestellt, das intrakraniell injizierte Hirntumor-Gehirn-suchende klonale Unterlinien enthält. MDA-MB-231BR Luciferase-markierte Zellen wurden intrakraniell in das Gehirn von Nu / Nu-weiblichen Mäusen injiziert, und nach der Tumorbildung wurden die Gehirne isoliert, geschnitten und ex vivo kultiviert. Die Tumorschnitte wurden aufgenommen, um Tumorzellen zu identifizieren, die Luciferase exprimieren und ihre Proliferation und Invasion im Gehirnparenchym für bis zu 10 Tage zu überwachen. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Verwendung der Zeitraffermikroskopie, um das Wachstum und das invasive Verhalten der Tumorzellen nach der Behandlung mit ionisierender Strahlung oder Chemotherapie abzubilden. Die Reaktion von Tumorzellen auf Behandlungen kann durch Live-Imaging-Mikroskopie, Messung der Biolumineszenzintensität und Durchführung von Histologie an der Gehirnscheibe, die BCBM-Zellen enthält, visualisiert werden. Daher kann dieses Ex-vivo-Slice-Modell eine nützliche Plattform für die schnelle Prüfung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe allein oder in Kombination mit Bestrahlung sein, um Medikamente zu identifizieren, die auf das metastatische Wachstum des Gehirns eines einzelnen Patienten in der Mikroumgebung des Gehirns abzielen.
Introduction
Brustkrebs-Hirnmetastasen (BCBM) entstehen, wenn sich Zellen vom primären Brusttumor auf das Gehirn ausbreiten. Brustkrebs ist nach Lungenkrebs die zweithäufigste Ursache für Hirnmetastasen, wobei bei 10-16% der Patienten Metastasen auftreten1. Leider bleiben Hirnmetastasen unheilbar, da >80% der Patienten innerhalb eines Jahres nach ihrer Gehirnmetastasendiagnose sterben und ihre Lebensqualität aufgrund neurologischer Funktionsstörungen beeinträchtigtist 2. Es ist dringend notwendig, wirksamere Behandlungsmöglichkeiten zu finden. Einschichtige zweidimensionale oder dreidimensionale Kulturmodelle sind die am häufigsten verwendeten Methoden zur Prüfung von Therapeutika im Labor. Sie ahmen jedoch nicht die komplexe BCBM-Mikroumgebung nach, die ein Haupttreiber für den Tumorphänotyp und das Tumorwachstum ist. Obwohl diese Modelle nützlich sind, erfassen sie nicht die komplexen Tumor-Stroma-Interaktionen, die einzigartigen metabolischen Anforderungen und die Heterogenität der Tumore3. Um Tumor-Stroma-Interaktionen und Mikroumgebungsheterogenität genauer zu rekapitulieren, haben unsere Gruppe und andere begonnen, organotypische Hirnmetastasen-“Slice”-Kulturen mit patientenabgeleiteten Tumorzellen (primär oder metastasierend) oder Krebszelllinien 4,5,6 zu erzeugen. Im Vergleich zu klassischen In-vitro-Systemen kann dieses kurzfristige Ex-vivo-Modell relevantere Bedingungen für das Screening neuer Therapeutika vor der präklinischen Bewertung in großen Tierkohorten bieten.
Ex-vivo-Modelle wurden konstruiert und erfolgreich eingesetzt, vor allem zur Identifizierung erfolgreicher Behandlungen verschiedener Krebsarten. Sie benötigen wenige Tage der Beurteilung und können zusätzlich auf ein patientenspezifisches Arzneimittelscreening zugeschnitten werden. Zum Beispiel haben menschliche Blasen- und Prostatakrebs-Ex-vivo-Gewebe eine dosisabhängige Anti-Tumor-Reaktion von Docetaxel und Gemcitabin7 gezeigt. Ähnliche kolorektale Karzinome ex vivo Gewebe wurden entwickelt, um Chemotherapeutika Oxaliplatin, Cetuximab und Pembrolizumab8 zu screenen. Diese Anwendung wurde bei Bauchspeicheldrüsenkrebs unter Berücksichtigung der wesentlichen Wechselwirkung zwischen der stromalen Umgebung und den genotypischen und phänotypischen Merkmalen des duktalen Pankreas-Adenokarzinoms 9,10 weit verbreitet. Darüber hinaus wurden solche organotypischen Modelle für ähnliche Screenings bei Kopf-, Hals-, Magen– und Brusttumorenentwickelt 11,12.
Hier wird ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell von xenotransplantierten metastasierenden Tumorzellen des Brustkrebses in ihrer Mikroumgebung erzeugt. Mäuse wurden intrakraniell mit Brustkrebs Gehirn metastasieren Gehirn trophische MDA-MB-231BR Zellen13 in der Großhirnrinde Parietallappen – eine häufige Stelle der TNBC-Metastasierung14,15 und erlaubt, Tumore zu entwickeln. Aus diesen xenotransplantierten Tieren wurden Hirnschnitte erzeugt und ex vivo als organotypische Kulturen beibehalten,wie beschrieben 16,17. Dieses neuartige Ex-vivo-Modell ermöglicht die Analyse des Wachstums der BCBM-Zelle innerhalb des Gehirnparenchyms und kann verwendet werden, um therapeutische Wirkstoffe und Strahlungseffekte auf Tumorzellen in der Mikroumgebung des Gehirns zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie etabliert eine neuartige Ex-vivo-Hirnkulturmethode für explantierte Xenotransplantat-Hirntumoren. Wir zeigen, dass BCBM-Zellen MDA-MB-231BR-Zellen, die intrakraniell in das Gehirn von Mäusen injiziert werden, überleben und in Ex-vivo-Hirnschnitten wachsen können. Die Studie testete auch intrakraniell injizierte U87MG Glioblastom (GBM) -Zellen und fand auch heraus, dass diese Krebszellen überleben und in Gehirnschnitten wachsen (Daten nicht gezeigt). Wir glauben, dass dieses Modell übe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Julia Farnan, Kayla Green und Tiziana DeAngelis für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) und W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) unterstützt.
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
