Summary
Presentamos un protocolo para medir la respuesta a la droga y la radiación en tiempo real de las células metastásicas cerebrales del cáncer de mama en un modelo organotípico de corte cerebral. Los métodos proporcionan un ensayo cuantitativo para investigar los efectos terapéuticos de varios tratamientos en las metástasis cerebrales del cáncer de mama de manera ex vivo dentro de la interfaz del microambiente cerebral.
Abstract
La metástasis cerebral es una consecuencia grave del cáncer de mama para las mujeres, ya que estos tumores son difíciles de tratar y se asocian con malos resultados clínicos. Los modelos preclínicos de ratón de crecimiento metastásico cerebral (BCBM) del cáncer de mama son útiles pero son costosos, y es difícil rastrear las células vivas y la invasión de células tumorales dentro del parénquima cerebral. Aquí se presenta un protocolo para cultivos de cortes cerebrales ex vivo de ratones xenoinjertados que contienen sublíneas clonales de búsqueda de cerebro de cáncer de mama inyectado intraranalmente. Las células marcadas con la luciferasa MDA-MB-231BR se inyectaron intracranealmente en los cerebros de ratones hembra Nu/Nu, y después de la formación del tumor, los cerebros se aislaron, cortaron y cultivaron ex vivo. Las rebanadas tumorales fueron fotografiadas para identificar células tumorales que expresan luciferasa y monitorear su proliferación e invasión en el parénquima cerebral durante un máximo de 10 días. Además, el protocolo describe el uso de la microscopía de lapso de tiempo para obtener imágenes del crecimiento y el comportamiento invasivo de las células tumorales después del tratamiento con radiación ionizante o quimioterapia. La respuesta de las células tumorales a los tratamientos se puede visualizar mediante microscopía de imágenes en vivo, midiendo la intensidad de la bioluminiscencia y realizando histología en la rebanada cerebral que contiene células BCBM. Por lo tanto, este modelo de corte ex vivo puede ser una plataforma útil para la prueba rápida de nuevos agentes terapéuticos solos o en combinación con radiación para identificar medicamentos personalizados para atacar el crecimiento metastásico cerebral de cáncer de mama de un paciente individual dentro del microambiente cerebral.
Introduction
Las metástasis cerebrales del cáncer de mama (BCBM) se desarrollan cuando las células se diseminan del tumor primario de mama al cerebro. El cáncer de mama es la segunda causa más frecuente de metástasis cerebral después del cáncer de pulmón, con metástasis que ocurren en el 10-16% de las pacientes1. Desafortunadamente, las metástasis cerebrales siguen siendo incurables, ya que >80% de los pacientes mueren dentro de un año después de su diagnóstico de metástasis cerebral, y su calidad de vida se ve afectada debido a disfunciones neurológicas2. Existe una necesidad urgente de identificar opciones de tratamiento más efectivas. Los modelos de cultivo monocapa bidimensionales o tridimensionales son los métodos más utilizados en la prueba de agentes terapéuticos en el laboratorio. Sin embargo, no imitan el complejo microambiente BCBM, un importante impulsor del fenotipo y el crecimiento del tumor. Aunque estos modelos son útiles, no capturan las complejas interacciones tumor-estroma, los requerimientos metabólicos únicos y la heterogeneidad de los tumores3. Para recapitular más fielmente las interacciones tumor-estroma y la heterogeneidad del microambiente, nuestro grupo y otros han comenzado a generar cultivos organotípicos de metástasis cerebrales "slice" con células tumorales derivadas del paciente (primarias o metastásicas) o líneas celulares cancerosas 4,5,6. En comparación con los sistemas in vitro clásicos, este modelo ex vivo a corto plazo puede proporcionar condiciones más relevantes para el cribado de nuevas terapias antes de la evaluación preclínica en cohortes de animales grandes.
Los modelos ex vivo se han construido y utilizado con éxito principalmente para la identificación de tratamientos exitosos de varios tipos de cáncer. Requieren pocos días de evaluación y, además, se pueden adaptar a la detección de medicamentos específicos del paciente. Por ejemplo, los tejidos ex vivo de cáncer de vejiga y próstata humano han mostrado una respuesta antitumoral dependiente de la dosis de docetaxel y gemcitabina7. Se desarrollaron tejidos similares de carcinoma colorrectal ex vivo para detectar los fármacos quimioterapéuticos Oxaliplatino, Cetuximab y Pembrolizumab8. Esta aplicación ha sido ampliamente utilizada en cáncer de páncreas, considerando la interacción esencial entre el ambiente estromal y las características genotípicas y fenotípicas del adenocarcinoma ductal pancreático 9,10. Además, se han desarrollado modelos organotípicos para exámenes similares en tumores de cabeza, cuello, gástricos y de mama11,12.
Aquí, se está generando un modelo de corte cerebral ex vivo de células tumorales metastásicas cerebrales de cáncer de mama xenoinjertadas en su microambiente. A los ratones se les inyectó intracranealmente cáncer de mama cerebro metastásico cerebral trófico MDA-MB-231BR células13 en el lóbulo parietal de la corteza cerebral, un sitio común de metástasis TNBC 14,15 y se les permitió desarrollar tumores. Se generaron cortes cerebrales a partir de estos animales xenoinjertados y se mantuvieron ex vivo como cultivos organotípicos como se describe16,17. Este nuevo modelo ex vivo permite el análisis del crecimiento de las células BCBM dentro del parénquima cerebral y se puede utilizar para probar agentes terapéuticos y efectos de radiación en las células tumorales dentro del microambiente cerebral.
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Protocol
Este protocolo fue aprobado y sigue las pautas de cuidado animal por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Drexel. En este estudio se utilizaron ratones hembra atímicos Nu/Nu (6-8 semanas de edad).
1. Inyección intracraneal de células tumorales
- Esterilizar todo el equipo (pinzas, tijeras, tijeras de sutura, taladro manual) bajo un ciclo seco de un autoclave durante un máximo de 45 minutos en bolsas de esterilización, incluido un indicador de esterilización. Si realiza cirugías en varios animales, esterilice las herramientas entre animales con un esterilizador de cuentas calentado (hasta 3x).
- Anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de cuidado animal de los usuarios (por ejemplo, isoflurano (4% para la inducción, 1-2% de mantenimiento) y administrar analgesia (subcutánea, 0,1 ml de 0,1 mg / kg de buprenorfina SR-LAB) antes del inicio de la cirugía. Asegure una profundidad óptima de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
- Coloque los ratones en un marco estereotáxico e inmovilice la cabeza con barras auditivas estándar (Figura 1A). Aplique ungüento oftálmico en los ojos.
- Esterilizar la superficie de la cabeza mediante la aplicación repetida y alterna (3x) de hisopos de yodo y etanol al 70% antes de la incisión.
- Use un bisturí quirúrgico para hacer una incisión de línea media de 1 cm a través de la piel en un ángulo ligeramente diagonal con respecto a la línea imaginaria que divide el cerebro de los ratones en dos mitades simétricas para exponer el cráneo. Limpie la sangre con un hisopo de algodón.
- Desvíe la piel lateralmente para exponer el sitio de inyección: 2 mm a la derecha, 1 mm hacia adelante con referencia a la bregma (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).
- Use una broca de fresa (0,73 mm) para penetrar el cráneo +2ML, +1RC en el bregma y perfore un orificio con una ligera presión y movimiento de torsión.
- Use una jeringa de inyección cerebral para inyectar 5 μL de una solución de 100,000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferasa que expresa de manera estable) / μL en 1x PBS estéril insertando inicialmente la jeringa de 3.5 mm de profundidad en el cerebro.
- Deje que la jeringa se asiente durante 2 min. Tire de él hacia arriba aproximadamente 1 mm, y después de 2 minutos, inyecte lentamente la primera mitad del volumen.
- Espere otros 2 minutos antes de inyectar el resto y luego tire lentamente de la jeringa 3 minutos después de la inyección final.
NOTA: La inyección lenta es empírica al permitir que el volumen sea bien absorbido por el tejido cerebral y no cree fugas después de tirar de la jeringa, lo que puede provocar que las células cancerosas crezcan fuera del sitio previsto. - Aplique cera ósea en el sitio de inyección en el cráneo y luego use suturas de polipropileno para suturar el tejido. Los ratones se recuperarán dentro de los 5 minutos posteriores a la extracción de la anestesia.
- Controle su comportamiento inmediatamente después de la cirugía durante aproximadamente 10 minutos, 3 h más tarde y al día siguiente para determinar si se necesita un tratamiento especial, que incluye inyección de solución salina, alimentos blandos, etc., para ayudar a una recuperación rápida.
- Monitoree el crecimiento del tumor a través de imágenes de bioluminiscencia en el sistema de imágenes.
- Para esto, primero, encienda el oxígeno y el isoflurano en el sistema de imágenes. Permita que ambos se distribuyan a la cámara separada fuera de la caja de imágenes.
- Luego, encienda el software, inicialice el instrumento y elija la opción adecuada para visualizar y capturar todo el cuerpo del mouse.
- Coloque los ratones en la cámara separada con isoflurano y asegure una profundidad de anestesia óptima con un pellizco en el dedo del pie. Inyectar a los ratones por vía intraperitoneal con 200 μL de 30 mg/ml de luciferina.
- Transfiera el estómago de los ratones hasta la nariz de la cámara de imágenes suministrada con oxígeno e isoflurano. Bloquee la cámara y elija 2 minutos de exposición para comenzar a tomar imágenes.
- Utilice la herramienta ROI (región de interés) del software para cuantificar la señal bioluminiscente del tumor.
- Para analizar el tamaño del tumor, elija la herramienta de forma de círculo, colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor. Mida el ROI e informe las lecturas totales.
- Permitir el crecimiento del tumor sólido durante 12-14 días (o hasta que la luciferasa alcance aproximadamente 7.0 x 106 unidades) (Figura 1B) antes de generar cortes cerebrales.
NOTA: Aumentar el número de células a inyectar conducirá a un crecimiento tumoral más rápido; por lo tanto, la generación de cortes cerebrales puede ocurrir antes de 12 días. Por otro lado, un tumor más grande conducirá a más rebanadas de GFP + si se deja crecer durante 14 días. Después de 14 días, la salud de los ratones comienza a deteriorarse rápidamente; por lo tanto, el monitoreo de la salud animal debe aumentarse a una vez al día después del punto de tiempo de 10 días, y cualquier ratón que muestre signos de dolor y / o incomodidad debe usarse para generar las rebanadas.
2. Generar cortes cerebrales
NOTA: Realice los pasos después del aislamiento cerebral en una campana de flujo laminar estéril. Por lo general, es posible generar 35-40 rebanadas individuales que contienen células tumorales (señal de luciferasa) a partir de un ratón inyectado con células MDA-MB-231BR (Figura 1C).
- Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas en autoclave. Coloque la cortadora de tejido en la campana de flujo laminar estéril y limpie todas las herramientas e instrumentos con etanol al 70%.
- Después de 12-14 días después de la inyección intracraneal de células MDA-MB-231BR, anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de cuidado animal de los usuarios como se describe en 1.2. Asegure una profundidad óptima de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie.
- Retiren y coloquen sus cerebros rápidamente (dentro de los 45 s) en sacarosa-ACSF helada (4 °C) compuesta por lo siguiente: 280 mM de sacarosa, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM de glucosa, 10 mM HEPES, 5 mM de Na+-ascorbato, 3 mM de tiourea, 2 mM de Na+, 29 mM de piruvato; pH=7,3.
- Usando un bisturí afilado y estéril o una cuchilla de afeitar, corte el exceso de partes del cerebro que no contienen ningún tumor de todos los lados, incluida la parte inferior del cerebro.
- Lleve la forma del cerebro a un cubo no perfecto para sentarse sobre el papel de filtro humedecido ACSF en una tapa de plato de 60 mm para facilitar el corte.
NOTA: El tejido adicional del cerebro donde es poco probable que el tumor haya crecido se extirpa antes del corte para permitir la generación de rodajas en su mayoría GFP + y crear una forma del cerebro que sea estable en la superficie del instrumento y no se perturbe por las vibraciones causadas por el corte. - Coloque varias hojas de círculos de papel de filtro prehúmedos (con ACSF) en la plataforma de corte y coloque el tejido bloqueado encima de esta.
- Ajuste el tamaño de corte en el instrumento a 2 o 2.5 unidades en la regla provista para cortar el tejido en secciones de 200-250 μm.
NOTA: Las rodajas de hasta 350 μm o tan delgadas como 100 μm son viables. Para rebanadas <200 μm, use un vibratomo o un comprimido. - Use un pincel (sable) para transferir rebanadas de cerebro a un plato que contenga sacarosa ACSF y separe las rodajas bajo un microscopio de luz con agujas de 27 G.
- Identifique las rodajas positivas de GFP bajo el microscopio fluorescente y transfiéralas a un nuevo plato de 60 mm que contenga 2-3 ml de medios de rebanada para adultos (medio neurobasal A, suplemento de B12 al 2%, suplemento de N2 al 1%, glutamina al 1%, glucosa al 0,5%, penicilina de 10 U / ml y estreptomicina de 100 μg / ml) utilizando una pipeta estéril de 1 ml rota (abertura ancha).
NOTA: Se excluyen las rebanadas cerebrales que contienen células tumorales que crecen sobre la superficie del cerebro (tal vez debido a la fuga de células inyectables, etc.). - Transfiera 3-5 rodajas a cada inserto de cultivo de tejido de 30 mm y 0,4 μm de tamaño de poro en placas de 6 pocillos a una distancia que no permita crecer entre sí.
- Retire el exceso de medio de la superficie del inserto con una pipeta P1000, agregue 1 ml de medio de corte de ratón adulto debajo de cada inserto y equilibre el medio en la incubadora antes de cortar.
- Incubar los tejidos a 37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad durante 24 h antes de la toma de imágenes.
3. Imágenes IVIS de rebanadas
NOTA: Realice los pasos de adición de luciferasa e inhibidor en una campana de flujo laminar estéril.
- Pipetear 5 μL de 30 mg/ml de solución de luciferina en el medio debajo de los insertos levantando el inserto con fórceps y colocándolos de nuevo en el pozo después de la adición de luciferina a los medios en el pozo.
- Coloque la placa de 6 pocillos con la tapa dentro de la cámara de imágenes del instrumento debajo de la cámara estacionaria y cierre la puerta de la cámara.
- Abra el software e inicialice el instrumento.
- Elija la configuración de la cámara que permita la visualización y captura de un solo pozo por imagen. Mueva el escenario hacia arriba (FOV de 5 cm) y coloque el pozo que debe ser fotografiado directamente debajo de la cámara.
- Establezca el tiempo de imagen en el más apropiado dependiendo de la intensidad de la luciferasa que emitirá el tumor, que puede variar de 10 s a 5 min. Comience con el ajuste a 10 s y luego aumente si la señal es baja, pero manténgala consistente para todos los puntos de tiempo y condiciones hasta el final del experimento (Figura 1D).
- Use la herramienta ROI (herramienta de forma de círculo), colóquela alrededor de la forma y el tamaño del tumor, mida el ROI e informe las lecturas totales para cuantificar la señal bioluminiscente de cada tumor en la rebanada.
- Lleve la placa de vuelta a la campana de flujo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeramente el inserto del pozo.
- Aspire el medio, reemplácelo con 1 ml de medio fresco y vuelva a colocar el inserto en el pozo.
- Para experimentos en los que las rebanadas están siendo tratadas con varios compuestos como inhibidores, metabolitos, etc., prepare la concentración adecuada del reactivo en 1,2 ml de medios de corte cerebral en un tubo de 1,5 ml y luego transfiera 1 ml al pozo que contiene la rebanada.
- Repita este proceso cada 48 h durante la duración del estudio.
4. Imágenes en vivo del crecimiento tumoral en cortes cerebrales ex vivo
NOTA: Suministre insertos con suficiente medio (1,5 ml) para durar la duración del experimento, ya que no es posible agregar medio adicional durante la toma de imágenes en vivo.
- Coloque la placa de 6 pocillos en el soporte de placa del microscopio automatizado dentro de la incubadora (37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad).
- Abra el software, active brightfield en el primer cuadrante para ajustar la exposición necesaria para ver las rebanadas. Para encontrar la posición (coordenadas "xy") de la rebanada, navegue con "xy" en el segundo cuadrante para controlar las coordenadas "xyz" del microscopio.
- Seleccione la placa de 6 pocillos como el material de laboratorio utilizado para este experimento. Seleccione el editor de mapas de ROI y registre esa posición seleccionando un nuevo ROI, agregue y guarde ese ROI.
- Repita los mismos pasos para todas las demás regiones de interés en otros pozos. Después de haber agregado todos los ROI, guarde todos los ROI.
- En Protocolo, seleccione Borrar existente y seleccione Lapso de tiempo en Adquisición, seguido de seleccionar los canales de interés (en este caso, GFP).
- Desactive el enfoque automático en la configuración de enfoque y ajuste manualmente al enfoque adecuado para todos los sectores. Finalmente, ajuste la intensidad del campo brillante y la excitación del canal fluorescente y el tiempo de exposición al nivel apropiado.
- Configura el protocolo para adquirir imágenes cada 15 min durante 48 h.
- Guarde y ejecute el protocolo. Al final del experimento, el archivo guardado contendrá las imágenes de campo brillante y GFP capturadas para cada ROI.
- Para combinar las imágenes en un video, cambie el nombre de todas las imágenes de interés con el mismo nombre seguido de un número binario para organizarlas en el orden en que fueron capturadas (por ejemplo, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
- Abra ImageJ e importe las imágenes haciendo clic en Archivo > Importar > secuencia de imágenes. Seleccione los nombres de archivo que aparecen en una lista y escriba el contenido del nombre de los archivos en el cuadro Contiene nombre de archivo que aparecerá para identificar los archivos seleccionados para el vídeo.
- Guarde las imágenes combinadas en Archivo > Guardar como > AVI.
5. Ensayo MTS e inmunohistoquímica del tejido cerebral ex vivo
- ENSAYO MTS
- Elimine las rodajas cortando la membrana de cultivo de tejido debajo de cada rebanada a lo largo de los bordes del tejido y transfiera el tejido, aún unido a la membrana, en una placa de 96 pocillos.
- Añadir el reactivo MTS mezclado en una proporción de 1:5 con medios de cultivo y tritón al 0,01% (1x) para permitir la penetración de la solución en el tejido, en un volumen total de 120 μL en cada pocillo.
- Use paraformaldehído al 4% (PFA) como agente para hacer que las rebanadas cerebrales sean inviables y, por lo tanto, un control positivo para este experimento. Sumerja la rebanada cerebral de interés en PFA al 4% durante 1 h a RT (temperatura ambiente) o durante la noche a 4 ° C antes de continuar con el ensayo MTS.
- Permita que el reactivo MTS reaccione sobre las rodajas durante 4 h, retire las rodajas de los pocillos y mida la absorbancia a 490 nm para todas las condiciones, incluido un pozo vacío sin rebanada como referencia.
- Informe las lecturas en función del área de corte de tejido, medida con una regla de pinza digital.
- Preparación inmunohistoquímica
- Sumerja las rodajas cerebrales unidas a la superficie del inserto de membrana en formalina al 10% durante la noche a 4 °C.
- Realizar incrustaciones, procesar, bloquear y generar portaobjetos no manchados del tejido. Utilice el protocolo de tinción inmunohistoquímica estándar para teñir para H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI
6. Irradiación del tumor en rodajas cerebrales ex vivo
- Irradiar el tumor con 6 Gy (radiografías de 310 kVp).
NOTA: Las unidades ingresadas para obtener la dosis total de 6 Gy son 3522 unidades después de considerar las unidades R (medidas con el electrómetro Victoreen) y las correcciones para el dedal, la densidad del aire y cGy / R como se describió anteriormente18. El tiempo de exposición es de 130,9 s. - Utilice 0,25 mm Cu + 1 mm Al filtración añadida, 50 cm SSD, 125 cGy por minuto.
- Realice la dosimetría mediante una cámara de ionización en el haz calibrada contra un estándar primario.
- Haga correcciones diarias para la humedad, la temperatura y la presión barométrica.
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Representative Results
Las células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa se inyectaron intracranealmente en el hemisferio derecho de ratones Nu/Nu de 4-6 semanas de edad como se explicó anteriormente (Figura 1A) y se les permitió crecer durante 12-14 días, tiempo durante el cual el crecimiento del tumor fue monitoreado por imágenes de bioluminiscencia (Figura 1B). Inyectamos 100,000 células cancerosas intracranealmente según lo informado por otros grupos19, pero es posible inyectar tan solo 20,000 células20. Después de la generación de cortes cerebrales (Figura 1C), como se describió anteriormente, se tomaron imágenes de rebanadas en el IVIS para determinar la presencia de tumores a través de imágenes bioluminiscentes después de la incubación de 24 horas. Esto se considera como el día 0. El crecimiento tumoral se monitoreó cuantificando la señalización bioluminiscente cada 48 h, lo que indicó un crecimiento progresivo durante 6 días (Figura 1D). La tinción H&E y la fluorescencia GFP positiva confirman la presencia de un tumor en la rebanada cerebral (Figura 1D). También pudimos detectar tinción de astrocitos reactivos, visualizada por tinción para células positivas para proteína ácida fibrilar glial (GFAP), visible entre el grupo de células cancerosas (GFP-positiva) (Figura 1D) similar a lo que se ve in vivo21. A diferencia de los modelos que inoculan células cancerosas ex vivo en una rebanada de cerebro de ratón22, este modelo contiene astrocitos reactivos, que es un aspecto importante del microambiente tumoral BCBM. También detectamos un aumento de la tinción de Ki-67 que confirma que las células cancerosas son altamente proliferativas (Figura 1D). Por lo tanto, las células tumorales dentro del parénquima cerebral pueden sobrevivir y proliferar dentro de una rebanada cerebral ex vivo durante varios días y también contienen estroma asociado al tumor.
La irradiación (IR) es una de las primeras líneas de tratamiento para los pacientes que presentan metástasis cerebrales en la clínica. Para comprender cómo respondería el modelo de rebanada ex vivo a dicho tratamiento, las rebanadas cerebrales que contenían tumores de luciferasa MDA-MB-231BR-GFP fueron expuestos a la irradiación 6Gy. Los tumores en rebanadas cerebrales que no fueron expuestas a la irradiación continuaron creciendo ex vivo, mientras que los tumores expuestos a la irradiación mostraron un crecimiento estancado (Figura 2A). Las rebanadas cerebrales que contienen tumores MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa también se monitorearon a través de imágenes en vivo durante 48 horas después del día 4 para visualizar el crecimiento tumoral en el microambiente cerebral después del tratamiento ir (Figura 2B). De acuerdo con las imágenes bioluminiscentes, se observa que las células cancerosas de control crecen rápidamente a medida que aumenta la intensidad de la GFP y se ven varias células que invaden el parénquima cerebral (Video 1). Por el contrario, las células cancerosas en rebanadas cerebrales tratadas con 6Gy IR son citostáticas y se mantiene la intensidad de GFP (Video 2). La tinción de H&E confirma tumores más pequeños en células tratadas con IR (Figura 2C). También detectamos grandes células cancerosas multinucleadas y un aumento en la tinción del marcador de daño al ADN g-H2AX en células cancerosas tratadas con IR (Figura 2C). No se detectó un aumento de la apoptosis en las rebanadas tratadas con IR, lo que sugiere que la IR puede reducir la proliferación (Figura 2C). Sin embargo, se detectó un aumento en la tinción en astrocitos reactivos, visualizado por tinción para células GFAP-positivas, que son visibles alrededor del grupo de células cancerosas (GFP-positivas) tratadas por IR (Figura 2C). Esto sugiere que este modelo ex vivo también puede ser útil para comprender cómo responden algunos componentes del estroma tumoral a los tratamientos. Además, no detectamos ninguna apoptosis causada por el tratamiento ir de rebanadas de ratón cerebral libre de tumores (Figura 2D).
También probamos si los tumores preformados con MDA-MB-231BR en rebanadas cerebrales responderían a la quimioterapia. Las rebanadas cerebrales que contenían tumores MDA-MB-231BR fueron tratadas a diferentes concentraciones de paclitaxel (Figura 3A), un fármaco quimioterapéutico utilizado en pacientes con cáncer de mama23. El tratamiento disminuyó el tamaño del tumor según lo cuantificado por la señalización bioluminiscente, pero esta inhibición solo fue significativa después del día 10 de tratamiento (Figura 3A). Esto puede deberse a una respuesta heterogénea al paclitaxel ex vivo. Por ejemplo, en los 40 nM tratados bien, una rebanada que contiene un tumor (arriba) se reduce mientras que el tumor (abajo) en el mismo pozo parece estar creciendo. Además, algunos de los tumores más pequeños parecían ser más sensibles al paclitaxel y exhibieron una bioluminiscencia reducida, mientras que los tumores más grandes parecían refractarios (Figura 3A, 80 nM tratamiento). Consistente con la reducción del tamaño del tumor, se detectó un aumento de la apoptosis en las células tumorales tratadas con paclitaxel en comparación con los controles (Figura 3B). Es importante destacar que, utilizando un ensayo MTS de viabilidad adaptado de Mews et al. para incorporar el uso de tritón24, probamos que el tratamiento con inhibidores no alteraba la viabilidad del tejido cerebral (en ausencia de tumor) (Figura 3C). De acuerdo con este resultado, no detectamos ni aumentamos la apoptosis medida por la tinción de caspasa 3 escindida en una rebanada de cerebro de ratón libre de tumor tratada con paclitaxel (Figura 3D). Estos datos sugieren que este modelo puede ser útil para comprender la respuesta quimioterapéutica y la resistencia de BCBM dentro de un microambiente cerebral. Debido a la naturaleza del modelo, un entorno ex vivo que conserva las propiedades e interacción cerebro-tumor, su esencialidad radica en proporcionar evidencia primaria de la respuesta de BCBM a los reactivos quimioterapéuticos y así eliminar los fármacos que no encogen el tumor en este modelo de futuros ensayos in vivo , que siguen siendo esenciales para validar el efecto de los fármacos que proporcionan resultados positivos en este modelo, la respuesta sistémica en el organismo y la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica.
Figura 1. Inyección intracraneal, generación de cortes cerebrales y crecimiento de BCBM ex vivo. (A) Representación esquemática del ratón durante la inyección intracraneal bajo un instrumento estereotáctico. (B) Imágenes representativas de la detección bioluminiscente de tumores de ratones Nu/Nu de 4-6 semanas de edad inyectados con 5 x 105 células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa 12 días después de la inyección. (C) Representación esquemática de la generación de cortes cerebrales de ratón ex vivo a partir de (B). (D) Imágenes representativas que representan el crecimiento tumoral en rebanadas cerebrales organotípicas derivadas de ratones inyectados intracranealmente con células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa detectadas a través de bioluminiscencia durante 6 días. H&E & Ki-67, GFP (células tumorales) GFAP (astrocitos reactivos) TINCIÓN DAPI (núcleo) de una rebanada cerebral representativa con tumor (aumento de imagen 20x, barra de escala: 200 μm). La cuantificación del crecimiento tumoral representa la señal de bioluminiscencia en relación con el día 0 (n = 3). La prueba t de Student reportada como media ± SEM, * p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Tratamiento de las rodajas cerebrales organotípicas de BCBM con radiación. (A) Imágenes representativas que representan el crecimiento tumoral en rebanadas cerebrales organotípicas derivadas de ratones inyectados intracranealmente con células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa detectadas a través de bioluminiscencia. Los tumores se exponen a ninguna irradiación o irradiación de 6 Gy (una dosis) y se dejan crecer durante los días indicados. Cuantificación del crecimiento tumoral al día indicado (control. n = 3; 6Gy, n=3). La prueba t de Student reportada como media ± SEM. * p < 0.05. (B) Se tomaron imágenes de cortes cerebrales durante 48 h cada 15 minutos. Las imágenes representativas de videos de muestras no irradiadas e irradiadas indican el crecimiento del tumor. (C) Las rebanadas, tal como se tratan en (A), se fijaron y ensayaron para la tinción H&E, g-H2AX, DAPI, Caspasa-3 escindida (CC3) y GFP (aumento de imagen 20x, barra de escala: 200 μm). (D) Las rebanadas de cerebro de ratón libres de tumor se trataron como en (A) y se fijaron y ensayaron para CC3 y DAPI (aumento de imagen 20x, barra de escala: 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Tratamiento de las rodajas cerebrales organotípicas de BCBM con paclitaxel. (A) Cortes de cerebro derivados de ratones inyectados intracranealmente con células de MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa tratadas con DMSO o después del tratamiento de paclitaxel a 40 nM, 80 nM, 160 nM y 320 nM durante 10 días, reponiendo el medio cada 48 h y dejándolo crecer durante los días indicados (aumento de imagen 20x, barra de escala: 200 μm). Cuantificación del crecimiento tumoral al día indicado (control n = 6, Paclitaxel n = 3) (abajo). La prueba t de Student reportada como media ± SEM. * p < 0.05. (B) Se recolectaron, fijaron y ensayaron cortes cerebrales ex vivo tratados en (A) con DMSO o paclitaxel de 320 nM para GFP, CC3 y DAPI (aumento de imagen 20x, barra de escala: 200 μm). (C) La rebanada de cerebro ex vivo tratada en (A) (sin tumor) con DMSO o 320 nM paclitaxel se recolectó en el día 10 y se analizó para determinar la viabilidad celular (ensayo MTS). Como control positivo, las rebanadas fueron tratadas con paraformaldehído (PFA) que hace inviables las rebanadas cerebrales (n = 3) La prueba t de Student reportada como media ± SEM. * p < 0.05. (D) Se recogió, fijó y ensayó una rebanada cerebral ex vivo tratada en (A) (sin tumor) con DMSO o paclitaxel de 320 nM para CC3 y DAPI (aumento de imagen 20x, barra de escala: 200 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1. Imágenes en vivo de cortes cerebrales organotípicos de BCBM. Se permitió que las rebanadas cerebrales derivadas de ratones inyectados intracranealmente con células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa crecieran durante 4 días y luego se colocaron bajo un microscopio de imagen en vivo durante 48 horas, donde se tomaron imágenes cada 15 minutos y se combinaron para crear un video usando ImageJ. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 2. Imágenes en vivo de cortes cerebrales organotípicos bcbm irradiados. Las rebanadas cerebrales derivadas de ratones inyectados intracranealmente con células MDA-MB-231BR-GFP-Luciferasa fueron irradiadas el día después de que se generaron las rebanadas y 4 días después fueron fotografiadas cada 15 minutos durante 48 h. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Este estudio establece un nuevo método de cultivo cerebral ex vivo para tumores cerebrales de xenoinjerto explantados. Demostramos que las células BCBM MDA-MB-231BR inyectadas intracranealmente en el cerebro de ratones pueden sobrevivir y crecer en rodajas cerebrales ex vivo . El estudio también probó células de glioblastoma U87MG (GBM) inyectadas intracranealmente y también encontró que estas células cancerosas sobreviven y crecen en cortes cerebrales (datos no mostrados). Creemos que este modelo se puede expandir más allá de BCBM y GBM a otros cánceres que hacen metástasis fácilmente en el cerebro, incluido el cáncer de pulmón y el melanoma. Se eligieron inyecciones intracraneales de células tróficas cerebrales de cáncer de mama ya que es un método sencillo y rápido para generar tumores cerebrales y es considerado como un modelo adecuado para las macrometástasis cerebrales25. Sin embargo, se pueden desarrollar modelos similares de rebanadas tumorales a partir de la inoculación intracardíaca o las inyecciones ortotópicas en almohadillas de grasa primarias. La optimización de las condiciones de cultivo mediante el cultivo de rebanadas de cerebro adulto en medio libre de suero y el suministro de medio fresco cada 48 h proporcionó una mejor preservación de la viabilidad del tejido y la supervivencia y el crecimiento de los tumores. Los insertos de 0,4 μm utilizados en condiciones hiperóxicas de la incubadora sirven como soporte estructural para las rodajas cerebrales ex vivo y también proporcionan una conexión con el suministro artificial de nutrientes y oxígeno al tejido y las células tumorales en ausencia de suministro de sangre que parece ser adecuado para mantener la viabilidad del tejido durante al menos diez días en cultivo. Las imágenes en vivo representan el crecimiento del tumor en función del aumento de la señal GFP. Sin embargo, el software tiene un umbral de luminosidad máxima de GFP que satura la señal y no permite la identificación adecuada de la motilidad de una sola célula en el microambiente cerebral. La modificación futura de la detección de señales de software microscópico mejorará la capacidad de informar con precisión el aumento temporal de la señal GFP en función del crecimiento del tumor.
Este modelo también permite el monitoreo del crecimiento y la viabilidad del tumor a través de la tinción inmunohistoquímica. Es importante destacar que este modelo permitirá realizar pruebas rápidas de la eficacia de la sensibilidad a la radiación con o sin inhibidores de moléculas pequeñas de tumores cultivados en el microambiente cerebral. Demostramos que este modelo es susceptible tanto a tratamientos con radiación como a quimioterapia. Además, este sistema se puede utilizar para estudios ómicos como proteómica, metabolómica y genómica para comprender mejor el crecimiento del cáncer y la respuesta a los tratamientos dentro del microambiente cerebral. Además, probar la posible recaída de tumores al eliminar los inhibidores después de una exposición más corta permitiría una mayor comprensión de las vías quimiorresistentes únicas para las células cancerosas dentro del microambiente cerebral.
En resumen, hemos desarrollado una nueva rebanada cerebral ex vivo de cultivo de tejido tumoral de xenoinjerto que monitoreará el crecimiento tumoral y la interacción con el microambiente tumoral cerebral y para la detección rápida de agentes terapéuticos para bloquear el crecimiento tumoral en el cerebro.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos financieros que declarar.
Acknowledgments
Queremos agradecer a Julia Farnan, Kayla Green y Tiziana DeAngelis por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por el Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) y W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
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