Модель среза мозга Ex Vivo для изучения и нацеливания на метастатический рост опухоли головного мозга рака молочной железы
Summary
Мы представляем протокол для измерения лекарственного и радиационного ответа в режиме реального времени метастатических клеток рака молочной железы в органотипической модели среза мозга. Методы обеспечивают количественный анализ для изучения терапевтического воздействия различных методов лечения на метастазы в мозг от рака молочной железы ex vivo в интерфейсе микроокружения мозга.
Abstract
Метастазы в мозг являются серьезным последствием рака молочной железы для женщин, поскольку эти опухоли трудно поддаются лечению и связаны с плохими клиническими результатами. Доклинические мышиные модели метастатического роста рака молочной железы (BCBM) полезны, но стоят дорого, и трудно отслеживать живые клетки и инвазию опухолевых клеток в паренхиме мозга. Здесь представлен протокол для культур срезов мозга ex vivo от ксенотрансплантированных мышей, содержащих внутрикраниально введенные клональные сублинии рака молочной железы. Клетки, помеченные люциферазой MDA-MB-231BR , вводились интракраниально в мозг самок мышей Nu/Nu, и после образования опухоли мозги были выделены, разрезаны и культивированы ex vivo. Срезы опухоли были сфотографированы для идентификации опухолевых клеток, экспрессирующих люциферазу, и мониторинга их пролиферации и инвазии в паренхиме головного мозга в течение 10 дней. Кроме того, протокол описывает использование покадровой микроскопии для изображения роста и инвазивного поведения опухолевых клеток после лечения ионизирующим излучением или химиотерапией. Реакция опухолевых клеток на лечение может быть визуализирована с помощью микроскопии с живой визуализацией, измерения интенсивности биолюминесценции и выполнения гистологии на срезе мозга, содержащем клетки BCBM. Таким образом, эта модель среза ex vivo может быть полезной платформой для быстрого тестирования новых терапевтических агентов отдельно или в сочетании с радиацией для идентификации лекарств, персонализированных для нацеливания на метастатический рост рака молочной железы отдельного пациента в микросреде мозга.
Introduction
Метастазы рака молочной железы в мозг (BCBM) развиваются, когда клетки распространяются от первичной опухоли молочной железы к мозгу. Рак молочной железы является второй наиболее частой причиной метастазирования в мозг после рака легких, причем метастазы встречаются у 10-16% пациентов1. К сожалению, метастазы в мозг остаются неизлечимыми, так как >80% пациентов умирают в течение года после постановки диагноза метастазирования в мозг, а качество их жизни ухудшается из-за неврологических дисфункций2. Существует острая необходимость в определении более эффективных вариантов лечения. Однослойные двухмерные или трехмерные модели культур являются наиболее часто используемыми методами тестирования терапевтических агентов в лаборатории. Тем не менее, они не имитируют сложную микросреду BCBM, основной фактор фенотипа и роста опухоли. Хотя эти модели полезны, они не охватывают сложные опухолево-стромальные взаимодействия, уникальные метаболические требования и гетерогенность опухолей3. Чтобы более точно повторить опухолево-стромальные взаимодействия и гетерогенность микроокружения, наша группа и другие начали генерировать органотипические культуры метастазов в мозг с опухолевыми клетками, полученными от пациента (первичными или метастатическими) или раковыми клеточными линиями 4,5,6. По сравнению с классическими системами in vitro, эта краткосрочная модель ex vivo может обеспечить более подходящие условия для скрининга новых терапевтических средств до доклинической оценки в больших когортах животных.
Модели ex vivo были построены и успешно используются в первую очередь для выявления успешных методов лечения различных видов рака. Они требуют нескольких дней оценки и, кроме того, могут быть адаптированы к скринингу лекарств для конкретного пациента. Например, ткани мочевого пузыря и предстательной железы ex vivo показали дозозависимый противоопухолевый ответ доцетаксела и гемцитабина7. Подобные ткани колоректальной карциномы ex vivo были разработаны для скрининга химиотерапевтических препаратов Оксалиплатина, Цетуксимаба и Пембролизумаба8. Это применение широко используется при раке поджелудочной железы, учитывая существенное взаимодействие между стромальной средой и генотипическими и фенотипическими характеристиками аденокарциномы протоков поджелудочной железы 9,10. Кроме того, такие органотипические модели были разработаны для аналогичных скринингов опухолей головы, шеи, желудка и молочной железы11,12.
Здесь генерируется модель среза мозга ex vivo ксенотрансплантированных метастатических опухолевых клеток рака молочной железы в их микросреде. Мышам интракраниально вводили метастатические трофическиеклетки мозга MDA-MB-231BR рака молочной железы – общий участок метастазирования TNBC14,15 и позволяли развивать опухоли. Срезы мозга были получены из этих ксенотрансплантированных животных и поддерживались ex vivo как оловоорганические культуры, как описано16,17. Эта новая модель ex vivo позволяет анализировать рост клеток BCBM в паренхиме мозга и может быть использована для тестирования терапевтических агентов и радиационного воздействия на опухолевые клетки в микроокружении мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование устанавливает новый метод культивирования мозга ex vivo для эксплантированных опухолей головного мозга ксенотрансплантата. Мы показываем, что клетки BCBM MDA-MB-231BR, интракрационно вводимые в мозг мышей, могут выживать и расти в срезах мозга ex vivo . Исследование также…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотим поблагодарить Джулию Фарнан, Кайлу Грин и Тициану ДеАнджелис за их техническую помощь. Эта работа была частично поддержана Пенсильванской универсальной программой грантов на улучшение исследований (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) и благотворительными фондами W.W. Smith (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
