Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei
Summary
We introduceren een protocol voor het meten van real-time medicijn- en stralingsrespons van borstkanker hersenmetaster gemetastaseerde cellen in een organotypisch hersenplakmodel. De methoden bieden een kwantitatieve test om de therapeutische effecten van verschillende behandelingen op hersenmetastasen van borstkanker op een ex vivo manier binnen de micro-omgevingsinterface van de hersenen te onderzoeken.
Abstract
Hersenmetastase is een ernstig gevolg van borstkanker voor vrouwen, omdat deze tumoren moeilijk te behandelen zijn en geassocieerd zijn met slechte klinische resultaten. Preklinische muismodellen van borstkanker hersen gemetastaseerde (BCBM) groei zijn nuttig, maar zijn duur, en het is moeilijk om levende cellen en tumorcel invasie in de hersenen parenchym te volgen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor ex vivo hersenplakculturen van xenogegrafeerde muizen die intracranieel geïnjecteerde borstkanker hersenzoekende klonale sublijnen bevatten. MDA-MB-231BR luciferase gelabelde cellen werden intracranieel geïnjecteerd in de hersenen van Nu / Nu vrouwelijke muizen, en na tumorvorming werden de hersenen geïsoleerd, gesneden en ex vivo gekweekt. De tumorplakken werden in beeld gebracht om tumorcellen te identificeren die luciferase tot expressie brengen en hun proliferatie en invasie in het hersenparenchym gedurende maximaal 10 dagen te volgen. Verder beschrijft het protocol het gebruik van time-lapse microscopie om de groei en het invasieve gedrag van de tumorcellen in beeld te brengen na behandeling met ioniserende bestraling of chemotherapie. De reactie van tumorcellen op behandelingen kan worden gevisualiseerd door live-imaging microscopie, het meten van de intensiteit van bioluminescentie en het uitvoeren van histologie op de hersenschijf die BCBM-cellen bevat. Dit ex vivo slice-model kan dus een nuttig platform zijn voor het snel testen van nieuwe therapeutische middelen alleen of in combinatie met straling om geneesmiddelen te identificeren die zijn gepersonaliseerd om zich te richten op de met gemetastaseerde groei van de hersenen van een individuele patiënt in de micro-omgeving van de hersenen.
Introduction
Borstkanker hersenmetastasen (BCBM) ontwikkelen zich wanneer cellen zich verspreiden van de primaire borsttumor naar de hersenen. Borstkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van hersenmetastasen na longkanker, met metastasen die voorkomen bij 10-16% van de patiënten1. Helaas blijven hersenmetastasen ongeneeslijk omdat >80% van de patiënten binnen een jaar na hun diagnose van hersenmetastase sterft en hun kwaliteit van leven is aangetast als gevolg van neurologische disfuncties2. Er is een dringende behoefte om effectievere behandelingsopties te identificeren. Monolaagse tweedimensionale of driedimensionale kweekmodellen zijn de meest gebruikte methoden bij het testen van therapeutische middelen in het laboratorium. Ze bootsen echter niet de complexe BCBM-micro-omgeving na, een belangrijke aanjager van tumorfenotype en groei. Hoewel deze modellen nuttig zijn, vangen ze niet de complexe tumor-stromale interacties, de unieke metabole vereisten en de heterogeniteit van de tumoren3. Om tumor-stromale interacties en micro-omgeving heterogeniteit getrouwer te reconstrueren, zijn onze groep en anderen begonnen met het genereren van organotypische hersenmetastase “slice” -culturen met patiënt-afgeleide tumorcellen (primair of gemetastaseerd) of kankercellijnen 4,5,6. In vergelijking met klassieke in vitro systemen kan dit ex vivo model op korte termijn relevantere voorwaarden bieden voor het screenen van nieuwe therapieën voorafgaand aan preklinische beoordeling in grote diercohorten.
Ex vivo modellen zijn geconstrueerd en met succes gebruikt, voornamelijk voor de identificatie van succesvolle behandelingen van verschillende kankers. Ze vereisen enkele dagen beoordeling en kunnen bovendien worden afgestemd op patiëntspecifieke geneesmiddelenscreening. Bijvoorbeeld, menselijke blaas en prostaatkanker ex vivo weefsels hebben een dosisafhankelijke anti-tumorrespons van docetaxel en gemcitabine7 aangetoond. Vergelijkbare colorectale carcinoom ex vivo weefsels werden ontwikkeld om chemotherapeutische geneesmiddelen Oxaliplatine, Cetuximab en Pembrolizumab 8 tescreenen. Deze toepassing is op grote schaal gebruikt bij alvleesklierkanker, gezien de essentiële interactie tussen de stromale omgeving en de genotypische en fenotypische kenmerken van pancreas ductaal adenocarcinoom 9,10. Bovendien zijn dergelijke organotypische modellen ontwikkeld voor vergelijkbare screenings in hoofd-, nek-, maag- en borsttumoren 11,12.
Hier wordt een ex vivo brain slice model van xeno getransplanteerde borstkanker hersen gemetastaseerde tumorcellen in hun micro-omgeving gegenereerd. Muizen werden intracranieel geïnjecteerd met borstkanker hersen gemetastaseerde hersentrofische MDA-MB-231BR cellen13 in de hersenschors pariëtale kwab – een gemeenschappelijke plaats van TNBC-metastase14,15 en lieten tumoren ontwikkelen. Hersenplakken werden gegenereerd uit deze xenogetransplanteerde dieren en ex vivo onderhouden als organotypische culturen zoals beschreven16,17. Dit nieuwe ex vivo model maakt de analyse van de groei van BCBM-cellen in het hersenparenchym mogelijk en kan worden gebruikt om therapeutische middelen en stralingseffecten op tumorcellen in de micro-omgeving van de hersenen te testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie stelt een nieuwe ex vivo hersenkweekmethode vast voor geëxplanteerde xenograft hersentumoren. We tonen aan dat BCBM-cellen MDA-MB-231BR-cellen die intracranieel in de hersenen van muizen worden geïnjecteerd, kunnen overleven en groeien in ex vivo hersenplakken. De studie testte ook intracraniaal geïnjecteerde U87MG glioblastoom (GBM) cellen en ontdekte ook dat deze kankercellen overleven en groeien in hersenplakken (gegevens niet getoond). Wij geloven dat dit model kan worden uitgebreid v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Julia Farnan, Kayla Green en Tiziana DeAngelis bedanken voor hun technische assistentie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) en W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel’s mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice–a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
